【 摘要 】目的研究肿瘤抗原p185蛋白作为肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤效应。 方法亲和层析纯化的p185蛋白皮下注射正常BALB/c小鼠，取脾细胞分别与p185蛋白、3T3-neu细胞体外共培养，以单独佐剂注射组的小鼠脾细胞为对照，观察其培养上清中IFN-γ和TNF-α活性。将免疫鼠脾淋巴细胞经p185抗原和低剂量的IL-2体外培养1周后，再用CD3抗体刺激扩增，用流式细胞仪分析其细胞表型。3T3-neu和3T3细胞分别接种于裸鼠腋窝皮下验证其致瘤性。选择具有致瘤性的3T3-neu细胞与经抗CD3抗体扩增的免疫鼠脾细胞体外混合后(19)接种于裸鼠腋窝皮下，以3T3-neu细胞单独或与CD3抗体活化的正常鼠脾细胞(CD3-AK)混合后，同法接种于裸鼠腋窝皮下观察其成瘤时间和带瘤宿主的存活期。 结果免疫鼠脾细胞培养上清中IFN-γ活性为40.27±9.6U/ml, 也具有产生较高TNF-α能力。对照组未能检测出有IFN-γ活性，其TNF-α活性也较低。裸鼠体内实验证实，2.5×10⁵的3T3-neu细胞在裸鼠体内即可成瘤，而对照组的3T3细胞无致瘤性。3T3-neu细胞与体外扩增的免疫鼠脾细胞混合后接种裸鼠，瘤结节形成时间平均为52.5 d,存活期平均为55.3 d(其中5只动物至60 d尚未成瘤，按60 d计算)，而对照组瘤结节形成时间平均分别为12.5和9.2 d，存活期平均为27.8和25.6 d。表明p185蛋白免疫鼠脾细胞有相对特异的抗瘤活性。 结论肿瘤抗原p185蛋白作为肿瘤疫苗可诱导一定的抗肿瘤效应。

Study on anti-tumor effect of the spleen cells

from p185 protein immunized mice

LI Xiaohua, QIN Hui-lian, HE Qiuzao. Department of Immunology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, P.R.China

【 Abstract 】ObjectiveTo study the anti-tumor effect of p185 oncoprotein as a tumor vaccine. Methods

The anti-tumor effect in vitro/vivo was studied by using the p185 antigen as a tumor protein vaccine to immunize mice. The splenic lymphocytes from the immunized mice were incubated with p185 tumor antigen for 4 days in vitro, then the supernatant was harvested for detecting the IFN-γ activity. The immune splenic lymphocytes in presence of a low dose(10μg/ml)IL-2-containing medium were cultured with p185 antigen for one week and expanded with anti-CD3 antibody. The phenotypes of expanded lymphocytes were detected by FACS. The TNF activity secreted by the expanded lymphocyte cells after co-incubated with 3T3-neu cells for 4 hours was also tested. 3T3-neu cells with tumorgenicity in nude mice admixed with the expanded lymphocytes (19) in vitro and was then inoculated (s.c.) into nude mice, 3T3-neu cells were inoculated alone or admixed with anti-CD3 activated spleen cells (CD3-AK) as control group. ResultsIFN-γ activity in the supernatant was 40.27±9.6U/ml in experimental group(splenocytes from immunized mice), but was undetected in control group (immunized with adjuvant alone). 86.2% expanded lymphocytes were CD3 positive T cells, in which 23% were CD8 positive T cells. The TNF activity was significantly higher in the supernatant from the experimental spleen cells culture than that from control (P＜0.001). The mean occurrence time of the tumor nodes was 52.5 days in experimental group (among no tumor occurs in 5/6 animals within more than 60 days after inoculation) and 12.5 days or 9.2 days in both control group respectively. The mean survival time of the tumor bearing nude mice was significantly extended in experimented group (55.3 days) than in control group (27.8 days and 25.6 days) respectively. ConclusionThese findings indicated that the p185 specific T cells may have an ability to inhibit the 3T3-neu tumor growth in vivo.

【 Subject words 】HER2/neu oncoprotein; Tumor vaccine; Immunotherapy

机体免疫系统特别是细胞免疫应答在机体抗肿瘤效应中起重要作用，但肿瘤往往能逃避机体免疫监视而继续发展。目前有一种观点认为，肿瘤抗原(TAA/TSA)不易被机体免疫系统识别，其原因之一可能是由于机体免疫系统对肿瘤抗原的优势表位已产生耐受，而其亚优势表位被包埋在分子内部不易被识别所致^〔1,2〕。如何使机体免疫系统很好的识别肿瘤抗原，产生有效的免疫应答以排斥肿瘤这是研究者期待解决的问题。

我们的研究结果以及国外的报道均证实，p185蛋白具有免疫原性，能刺激免疫系统产生免疫应答反应^〔3-6〕 ，但机体对p185阳性的肿瘤并不能产生排斥反应。本研究试图利用纯化的p185蛋白作为瘤苗注射，通过宿主抗原递呈细胞的加工处理而暴露某些亚优势抗原表位，诱导小鼠产生对p185肿瘤抗原的有效免疫应答。

材料与方法

材料及试剂：转染HER2/neu全长cDNA的3T3-neu细胞，WEHI 164细胞株由美国华盛顿大学肿瘤学系Mery L Disis教授惠赠，抗小鼠H-2k^d-FITC ,H-2K^b-FITC荧光标记单克隆抗体为PharMingen公司产品，抗小鼠CD3单抗，由本教研室黄辉讲师提供。抗小鼠CD3-FITC，CD4-FITC，CD8-FITC均为Sigma公司产品。IFN-γ检测试剂均由上海生物高技术公司提供，p185蛋白为经凝胶过滤和亲和层析纯化蛋白，本室自行制备(另文发表)。裸鼠由中科院上海药物研究所提供。

方法

1.p185蛋白免疫BALB/c小鼠：参见文献〔3〕。

2.转基因3T3-neu细胞表面H-2 Ⅰ类分子检测：参见文献〔4〕。

3.免疫鼠脾细胞的体外扩增及其表型测定^〔4-6〕：取免疫鼠脾淋巴细胞调整浓度为10⁶/ml,加100μg/ml p185蛋白粗制品，IL-2 10U/ml于24孔细胞培养板中，置37℃、6％CO₂孵箱中培养，隔日用含20U/ml的IL-2半量换液。连续培养1周后弃去上清，取一部分细胞用于以后检测TNF活性，小部分淋巴细胞加入含1100稀释的抗CD3单克隆抗体的RPMI 1640完全培养液，2～3d后收集细胞，用抗CD3-FITC或抗CD8-FITC染色后在流式细胞仪检测CD3及CD8细胞百分率。

4.免疫小鼠淋巴细胞诱生细胞因子功能

(1)IFN-γ检测:按前述方法用p185蛋白免疫BALB/c小鼠后取免疫鼠脾淋巴细胞，调整细胞浓度为10⁶/ml，加10μg/ml p185蛋白粗制品于24孔细胞培养板中37℃、6％ CO₂孵箱中培养，连续培养4d后收集上清，采用L929细胞－水泡性口炎病毒(VSV)实验系统分析法检测上清中IFN-γ。取对数期生长的L929细胞加入96孔反应板，2×10⁴细胞/孔，每孔分别加入稀释的待测培养上清和14稀释的IFN-γ标准品，于37℃、6％ CO₂孵箱中培养24h，弃上清并加入100μl的VSV病毒，设未加入培养上清的L929细胞和VSV病毒对照组，继续于37℃、6％ CO₂孵箱中培养24h,加入结晶紫显色，加入10％的SDS后检测吸光度(A)值(570nm)，按下述方法计算IFN－γ效价，结果以U/ml表示。

待测样品IFN-γ活性＝C×样品稀释倍数×标准品校正系数

(2)TNF活性检测：取上述(方法3)经CD3抗体扩增的T细胞为效应细胞，以3T3-neu细胞为靶细胞(3T3细胞为对照靶细胞)，按效靶比为101混合培养4h后,收集培养上清参照文献〔7〕检测TNF。

5.体外培养扩增的免疫鼠脾细胞在裸鼠体内的抗瘤效应：取p185蛋白免疫鼠脾细胞按上述方法加入p185蛋白培养后经抗CD3加低剂量IL-2扩增后收获效应细胞。选用最适致瘤数量的3T3-neu细胞与上述效应细胞按19混合后同上法接种裸鼠，设单独3T3-neu细胞或抗CD3抗体活化的杀伤细胞混合3T3-neu细胞接种裸鼠为对照组，观察肿瘤的生长及小鼠的生存期。

6.CD3－AK的制备：取正常BALB/c小鼠的脾淋巴细胞，加入含CD3单克隆抗体完全培养液体外培养约72h后即可获得CD3-AK细胞。

结果

1.转基因3T3-neu细胞表面H-2 Ⅰ类分子的表达：取对数期生长的3T3-neu转基因培养细胞，经直接免疫荧光法检测细胞表面H-2 Ⅰ类分子的表达，流式细胞仪检测结果(图1)显示，该细胞既表达H-2k^d 分子,也表达H-2K^b分子；进一步检测3T3细胞表型显示H-2k^d和H-2K^b分子分别为19.8%和15.5%，提示该3T3细胞有可能来源于非近交系小鼠，也有可能因转染HER2/neu基因而引起H-2 Ⅰ类分子表达的改变。

2.免疫小鼠脾细胞体外诱导的效应淋巴细胞表型分析：免疫小鼠脾淋巴细胞在体外经p185再刺激和扩增后，FACS检测其淋巴细胞表型，结果显示，CD3^＋细胞为86.2％，其中CD8^＋细胞占23％，其余几乎均为CD4^＋细胞(62.63%)，表明免疫鼠脾细胞扩增后细胞大部分为T淋巴细胞。

3.p185蛋白诱导免疫鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ