【 摘要 】目的构建表达幽门螺杆菌的组成成分热休克蛋白A亚单位(HspA)和尿素酶B亚单位(UreB)的重组蛋白质的侯选菌株。 方法用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上分别扩增出HspA和UreB基因片段，将它们融合插入原核表达载体pET-22b(+)中，并在BL21(DE3)大肠杆菌表达。 结果经测序，HspA-UreB(HU)融合基因片段由2061bp组成，为编码687个氨基酸残基的多肽。SDS-PAGE和免疫印迹分析检测发现，融合基因表达的蛋白相对分子质量约为78×10³，并证实该重组蛋白可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别，其免疫小鼠所得血清抗体可与纯化的HspA和UreB重组蛋白单体或融合体发生特异性的结合反应。同时观察到HspA的存在可使融合蛋白的尿素酶活性增加2倍以上。 结论HspA-UreB融合蛋白有可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。

Construction of bivalent vaccine candidate expressing HspA

and UreB subunit from Helicobacter pylori

LI Mingfeng^*, HE Zhiyong, LING Zhen, et al.^*Department of Gastroenterology, 455 Hospital of PLA, Shanghai 200052, P.R.China

【 Abstract 】ObjectiveBoth heat-shock protein A subunit (HspA) and urease B (UreB) subunit as effective immunogen may stimulate the immunoresponse protecting human body against challenge of H.pylori. A recombinant strain which expresses bivalent antigen of HspA and UreB subunit was constructed. MethodsGene encoding the structural A/B subunit of H.pylori heat-shock protein/ urease was amplified from H.pylori chromosomal DNA by PCR techniques. The genes were inserted into the prokaryotic expression vector pET-22b(+), and then was transformed into the BL-21(DE3) E.coli strain, expressed which HspA-UreB recombinant protein. ResultsHspA-UreB gene was found to be 2061 base pairs ,the recombinant fusion protein encoded polypeptides of 687 amino acid residues, corresponding to calculated molecular masses of 78kD. Western blot analysis of HspA-UreB recombinant protein confirmed that it could be specifically recognized by the serum from H.pylori-infected patients, and could also be recognized by the serum from BALB/c mice immunized with HspA-UreB itself. The urease activity of E.coli cells containing the UreB gene plus the HspA gene was two times greater than that of UreB lonely. ConclusionThis result suggested that HspA-UreB recombinant protein may be an potential vaccine for control and treatment of H.pylori infection.

【 Subject words 】Helicobacter pylori; Heat-shock protein A; Urease B; Bivalent genetic vaccine

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是上消化道疾病的主要致病菌，它的感染与B型胃炎和消化性溃疡的发生密切相关，并被世界卫生组织列为胃癌发生的相关致病菌^〔1〕。Hp在我国普通人群中的感染率较高，尤其在北方地区和青少年当中其感染率高达(80～100)%。如何预防和根除Hp感染是目前临床治疗的重点。免疫疗法有望成为治疗该类感染性疾病的最有效、最有前景的方法之一。

在Hp的免疫治疗研究方面，纯化的尿素酶(urease, Ure) 和热休克蛋白（heat shock protein，Hsp）及其亚单位成分均可以作为抗原免疫动物刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用^〔2,3〕。进一步的研究发现，Hsp蛋白的亚单位A即HspA，因其独特的结构和能结合镍离子的特性，使其与Ure的B亚单位(UreB)同时表达时，可明显地增强尿素酶的生物活性达4倍以上^〔4〕，为此，本实验将HspA和UreB两个目的基因插入同一表达载体，并在大肠杆菌中得到了高效表达，为Hp疫苗的研制奠定了基础。

材料和方法

菌株和质粒：幽门螺杆菌H. pylori ATCC 43504由上海仁济医院消化病研究所萧树东教授惠赠；菌株TG1、BL21（DE3）、质粒pSK（+）、质粒pET-22b(+)为中科院上海生物化学研究所吴祥甫教授组保存。BALB/c小鼠购自中科院上海生物化学研究所动物房。

限制性内切酶及连接酶：T4 DNA连接酶、限制性内切酶、Klenow酶等均购自Gibco BRL公司；Taq DNA聚合酶为MBI公司产品；X-gal、IPTG为Boehringer Mannheim公司产品；羊抗人IgG-辣根过氧化物酶和兔抗鼠IgG-碱性磷酸酶均为华美生物工程公司产品。

血清及其它生化试剂：Hp感染阳性病人血清来自解放军第四五五医院内窥镜室。以病人的胃窦粘膜作尿素酶检测和病理组织切片染色观察是否为Hp感染阳性来筛选血清。选取Hp感染阳性患者血清10例，正常人血清4例。其余试剂均为进口或国产分析纯。

总DNA的提取：从固体培养基上刮取适量生长状态良好的Hp菌落，置入100 μl无菌去离子水中，制成含菌浓度约为10⁷个/ml的菌液，直接加热煮沸2min，离心取上清置-20℃保存备用。

HspA DNA和UreB DNA的扩增：分别取Hp总DNA量2μl，按常规PCR条件进行扩增，即94℃变性5min，加入2U的Taq DNA 聚合酶，按如下参数循环35次：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，最后一个循环结束后72℃反应10min。

重组克隆及DNA序列分析：质粒抽提、酶切反应、电泳鉴定、DNA片段回收、连接反应及细菌转化等均参照《分子克隆》一书的技术操作略加修改进行。DNA测序按自动测序方法进行。

结果

1.幽门螺杆菌HspA和UreB目的基因：根据Suerbaum等^〔5〕报道的HspA DNA序列和Labigne等^〔6〕报道的UreB DNA序列，经微机分析分别设计两对引物。HspA引物：P1为5′-GACATATGAAGTTTCAACCA

TAAGG- 3′，P2为5′-GGGATCCGTGTTTTTTGTGATCAT

GAC - 3′。引物P1为HspA 蛋白N端的编码序列，引入起始密码子ATG及NdeⅠ酶切位点；引物P2为HspA蛋白C端编码序列的互补序列，并引入一个BamHⅠ酶切位点。UreB引物：P1为5′-GAAGATCTA

AAAAGATTAGCAGAAAAG- 3′，P2为5′-GGCTCGAGC

TAGAAAATGCTAAAGAGTT- 3′，引物P1引入BglⅡ酶切位点，P2引入XhoⅠ酶切位点，以Hp总DNA为模板分别进行PCR扩增，得到两条DNA片段HspA和UreB，其大小分别为354bp和1707bp。

2.HspA和UreB基因的克隆及序列分析：将得到的两条PCR产物片段分别经Klenow酶补平，与经EcoRⅤ酶切的pSK(+)质粒在T4 DNA连接酶作用下，18～22℃连接过夜。然后转化大肠杆菌TG1，用NdeⅠ，BamHⅠ或BglⅡ，XhoⅠ双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，分别挑取两个阳性克隆作序列检测。

3.HspA和UreB基因的融合及序列分析：将克隆至pSK(+)质粒中的HspA和UreB基因片段分别以NdeⅠ，BamHⅠ或BglⅡ，XhoⅠ双酶切，低熔点胶分离纯化，以BamHⅠ和BglⅡ酶切位点的互补性，将上述两个目的基因在T4 DNA连接酶作用下融合插入同一表达载体pET-22b(+)中，构建大肠杆菌表达质粒pET-HU(图1)，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定含有插入片段的重组质粒，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，可得到一条长约2070bp的目的DNA片段(图2)，分别挑取两个阳性克隆作序列分析。

图1重组质粒pET-HspA/UreB(pET-HU)的构建示意图

Fig 1. Schematic construction of plasmid pET-HspA/UreB(pET-HU)

图2幽门螺杆菌HspA-UreB DNA的琼脂糖凝胶电泳

Fig 2. Agaros gel electrophoresis of HspA-UreB DNA from Helicobacter pylori

1. Marker DNA (1kb DNA ladder); 2. HspA-UreB DNA fragment

4.HspA和UreB融合基因在大肠杆菌中的表达：将表达质粒pET-HU转化大肠杆菌BL21（DE3），筛选表达株BL-HU。将含表达质粒的单克隆菌落置于LB培养基（含氨苄青霉素100mg/L）中37℃培养至A600为0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，诱导表达4h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE（图3）。结果发现，经IPTG诱导后高效表达相对分子质量约为78×10³的蛋白，凝胶自动扫描分析，HspA-UreB重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20%左右。

图3HspA-UreB融合蛋白质的SDS-PAGE分析

Fig 3. SDS-PAGE analysis of HspA-UreB fusion protein expressed in BL21(DE3)

1. HspA cells before induction; 2. HspA cells after 4 h induction with iPTG; 3. HU cell