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cVB3m病毒感染可诱发心肌细胞凋亡，且随时间延长，凋亡量增多，凋亡程度加重，凋亡可能参与VMC的病理过程。
Preliminary study on myocardial cell apoptosis
induced by Coxsackie virus B3
ZHU Li'an, GUAN Ruijin, HU xizhong. Fujian Province
cardiovascular Institute, Fuzhou 350001,P.R.China
【 Abstract 】ObjectiveTo determine the relationship between CVB3's challenge and apoptosis in myocardial cells. MethodsThe micro-model of cultured new born rat heart cells infected by CVB3m was established. To observe the apoptotic cell's morphologic change by eM, measure “apoptotic peak” by flow cytometry, and detect histone-associated dNA-fragmes by ELISA. ResultsMorphologic features showed that aggregation of chromatins into denser masses lying at the periphery of the nucleus was observed by EM, “apoptotic peak” was detected by flow cytometry, and the photometric enzyme-immunoassay revealed strong positive signals of apoptosis in CVB3m infected cells. ConclusionThe CVB3m' infection can induce apoptosis in rat cardiomyocytes.
【 Subject words 】Coxsackie virus B3; Myocardial cell; Apoptosis
凋亡是指单个细胞受其内在基因的编程调控，通过主动的生化过程而“自杀”死亡的现象，是与病理性坏死不同的另一种细胞死亡方式。近年来研究发现：细胞凋亡失常（不足或过度）参与多种疾病的发生与发展〔1〕。病毒感染是调节凋亡的重要因素，病毒感染细胞后通过其自身基因的表达或激活宿主细胞凋亡相关基因启动或抑制细胞凋亡〔2〕。已证实能够引发细胞凋亡的病毒有流感病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）等。CVB3病毒感染心肌细胞诱发病毒性心肌炎（VMC），是由于病毒在心肌内增殖，引起炎症细胞浸润，可能还有自身免疫反应，导致多发性坏死，继以纤维化病灶〔3〕。然而一些实验中观察到VMC患者的心肌损伤并不都与炎症反应成正比，故有人提出，细胞凋亡可能通过产生非炎症性心肌损害参与VMC的发生与发展。在VMC的研究中引入凋亡概念，有助于从一个全新的角度探讨VMC的发病机制，本研究对CVB3病毒感染后心肌细胞的凋亡进行检测，旨在探讨细胞凋亡与VMC的关系。
材料与方法
原代乳鼠心肌细胞培养方法：参照Rui t的胰蛋白酶消化法〔4〕，实验用Sprague Dawlay乳鼠由福建闽兴实验动物中心提供。
CVB3病毒感染心肌细胞模型的建立：嗜鼠心肌柯萨奇B3病毒(CVB3m)，由美国ATCC引入，采用微量滴定法测其TCID50为4.5，以100TCID50/ml的CVB3m感染培养第3天的，接种于24孔板中，密度为2.0×105/ml的心肌细胞，作用1h后弃去病毒液，继续以MEM培养液培养。
相关检查
1.倒置显微镜检查：观察病毒感染后24h的心肌细胞。
2.电子显微镜检查：CVB3m病毒感染后24h的心肌细胞，用2.5%戊二醛固定，常规脱水，环氧树脂包埋，染色，切片，电镜观察。
3.流式细胞仪检测细胞“凋亡峰”：取培养于24孔板中的CVB3m病毒感染后24h的心肌细胞，0.15%胰蛋白酶分散，制成细胞悬液（细胞密度为104），低渗PI染液作用30min，流式细胞仪检测，Multiple option cell cycle fitting (Autofit Version 2.53)软件分析，观察是否在G1峰前出现凋亡特有的AP峰(apoptotic peak)，计算峰细胞数占总细胞数的百分比，取同时间培养的未感染心肌细胞作对照。
4.ELISA法检测凋亡细胞：培养于96孔板上生长良好的心肌细胞(5×104/ml)中加入100TCID50的CVB3m病毒液(100μl/孔)，37℃ cO2培养箱中孵育1h后弃去上清，加入200μl/孔的培养液继续培养。分别取培养后1、2、4、7、24h的培养上清液、细胞溶解液进行分析。采用未加CVB3m病毒液的正常培养心肌细胞作为阴性对照。具体步骤按细胞凋亡检测试剂盒（BM公司）说明进行。阳性对照由试剂盒提供，并设立空白对照（底物浓液），背景对照（孵育缓冲液），最后在酶标仪上405nm/490nm波长下测定吸光值，分别计算培养上清液及细胞溶解液中单、寡核小体的相对量，以富集因素（enrichment factor,EF）表示。计算公式为：
EF=(cell with treatment(mu))/(cell without treatment(mu))
结果
1.CVB3m病毒感染心肌细胞模型的建立：本研究在建立CVB3m病毒感染心肌细胞模型时按感染阳性百分率计算出病毒TCID50为4.5，选用病毒的攻击毒力为100TCID50。病毒在敏感细胞中繁殖，常可引起细胞代谢等方面的改变，并出现细胞病变（CPE），可以此来判定病毒感染的存在。本实验在CVB3m病毒感染心肌细胞后，细胞出现圆缩、坏死等形态学改变，随感染时间延长，病变范围扩大，细胞病变达+++～++++，电镜下观察感染细胞中可见病毒颗粒及包涵体，且检测培养液中AST、LDH、CK、CKMB的值明显高于正常对照组，心肌酶的升高与心肌损伤程度大致平行，这些均提示病毒感染导致了心肌细胞的损伤，胞膜通透性增高，细胞变性坏死，说明该模型的建立是成功的。
2.倒置显微镜下观察结果：可见病毒感染后细胞出现团缩、变圆、成堆、胞质灰暗。
3.电镜下观察结果：可见CVB3m感染心肌细胞有两种不同形态改变，一种是以细胞质改变为主（图1A），表现为线粒体肿胀，嵴变短、断裂，甚至成空泡样，肌浆网扩张，肌丝紊乱；另一种是以细胞核改变为主（图1B），表现为细胞膜内陷核染色质浓缩、集边，凝集成团块状，还可见核碎裂，细胞器变化不明显。
图1CVB3病毒感染后24h心肌细胞的形态分析
Fig 1. Morphological appearance of cardiac myocytes infected by CVB3 for24 h
A. CVB3m infected cardiac myocytes, which obviously revealed cytoplasmic pathogenesis(×10000)
B. CVB3m infected cardiac myocytes, which obviously revealed nucleolus pathogenesis(×7200)
4.流式细胞术鉴别细胞凋亡：流式细胞分析中可见CVB3m感染细胞出现凋亡特有的AP峰（图2A），而未感染心肌细胞则无凋亡峰出现（图2B）。
5.ELISA法检测核小体（组蛋白伴随DNA片段）：结果显示正常细胞上清液、病毒感染细胞上清液的吸光值均在各自一定的范围内波动，不随时间的延长而改变。病毒感染细胞溶解液测得的吸光值有随时间的延长而增高的趋势（表1），由1h的0.39l mu升至24h的2.427 mu，阳性对照的吸光值为
图2CVB3m感染后24h的流式细胞分析
Fig 2. Cytometric analysis of CVB3m infected cardiac myocytes
A. Apoptotic peak was found before G0/G1 peak(infected cells).
Cell cycle data A
Mean G1=88.9; mean G2=121; CV G1=6.5; CV g2=6.6;%G1=44.6; %G2=7.1; G2/G1=1.361;%S=4.1; %AP=14.3
B. No apoptotic peak was found before G0/G1 peak(uninfected cells).
Cell cycle data B
Mean G1=143.2; mean G2=286.0; CV G1=4.1; cV G2=2.8;%G1=74.9; %G2=6.9; G2/G1=1.997;%S=18.3
表1CVB3m病毒感染前后不同时间细胞溶解液及培养上清液吸光值（mu）变化
