【 摘要 】目的制备抗伤寒沙门菌Fe-SOD血清，研究其免疫保护作用，探讨SOD与沙门菌毒力的关系。 方法用纯化的伤寒沙门菌（Stw1）Fe-SOD免疫家兔制备兔抗Fe-SOD血清。利用ELISA法检测抗血清的效价。免疫电泳、双向琼脂扩散试验和抗体对酶活性抑制试验分析抗血清的特性。用不同浓度的抗血清预先处理Stw1，然后进行小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬杀菌试验，并利用鼠伤寒沙门菌感染小鼠模型证明抗SOD血清的被动免疫保护作用。 结果抗血清的ELISA效价为1∶10240，免疫电泳结果显示纯化的Fe-SOD及伤寒沙门菌无细胞溶解物与抗Fe-SOD血清在相同位置各形成一条沉淀线。双向琼脂扩散试验结果显示该抗血清与牛红细胞SOD不形成沉淀线，抗血清对酶活性抑制试验结果显示抗血清可抑制伤寒沙门菌及鼠伤寒沙门菌无细胞溶解物中部分SOD活性，对牛红细胞SOD的抑制率较低。小鼠腹腔吞噬细胞对伤寒沙门菌的吞噬杀菌试验结果显示，经中浓度的抗血清处理的细菌在60min、120min时和经高浓度抗血清处理的细菌在30min、60min及120min时CFU值明显低于对照组（P＜0.01）。经抗血清处理过的5LD₅₀鼠伤寒沙门菌攻击的小鼠3d和7d的存活率分别为90%和60%，均明显高于对照组（P＜0.05或P＜0.01）。 结论抗伤寒沙门菌SOD血清可促进小鼠腹腔吞噬细胞对伤寒沙门菌的杀灭，也能提高鼠伤寒沙门菌攻击小鼠的存活率，说明此抗血清具有免疫保护作用，提示SOD可能是沙门菌共同的保护性抗原，间接说明了伤寒沙门菌的SOD与其毒力有关。

Preparation of anti-Salmonella typhi Fe-SOD

and its immuno-protection

XU Junfa, TANG Xiangjuan. Department of Laboratory Medicine, Guangdong Medical College, Zhanjiang, P.R.China

【 Abstract 】ObjectiveTo prepare the anti-Salmonella typhi Fe-SOD and to study the immuno-protection of this antiserum. MethodsThe anti-Fe-SOD was raised in the rabbit immunized and then titrated by ELISA. The antiserum were further characterized by immuno-eletrophorisis, double agar difusion, enzym activity inhibition and opsonization test with murine peritoneal macrophages. ResultsThe titer of the antiserum was 1∶10240. The cell-free extracts and the purified Fe-SOD from S.typhi but not the SOD from bovine RBC formed identical precipitation line with the antiserum. The 63.39%-73.38% of SOD activities in cell-free extracts from different S.typhi were inhibited by the antiserum as shown in NBT reduction inhibition test, but only 42.59% and 24.92% SOD activity from S.typhimurium and bovine erythrocyte were inhibited, respectively by the antiserum(P＜0.01 or P＜0.05). The bacteria number of test groups where 1ml or 2ml of the anti-SOD were added were both much less than that in the control groups at 30min, 60min and 120min, respectively in a phagocytic killing test by murine peritoneal phagocytes (P＜0.01). The survival rates of mice in the group challenged with 5LD₅₀ S.typhimurium incubated with anti-Fe-SOD serum were 90% and 60% during a period of 3 days and 7 days, respectively. ConclusionThe results showed that the anti-Fe-SOD could not only strengthen the phagocytic killing of the bacteria by murine peritoneal phagocytes in vitro but also offers cross immuno-protection to the mice challenged with S.typhimurium. The SOD seems to function as common protective antigen of Salmonella.

【 Subject words 】S.typhi; S.typhimurium; SOD; Antiserum; Immuno-protection

吞噬细胞呼吸爆发过程中产生的超氧阴离子（O^₂）、过氧化氢（H₂O₂）、羟自由基（OH*）和单线态氧（¹O₂）是重要的杀微生物物质^〔1〕。病原微生物，尤其是细胞内寄生的细菌具有多种抗吞噬细胞杀伤的机制，其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalases，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）等可分解吞噬细胞产生的活性氧，从而保护细菌逃避吞噬细胞的杀伤。因此，SOD、CAT、POD被认为是某些细菌重要的毒力因子^〔1〕。已有报道，星形诺卡菌^〔2，3〕 、结核分枝杆菌^〔4〕、福氏志贺菌^〔5〕、大肠杆菌^〔6〕等的SOD与其毒力有关。星形诺卡菌SOD抗体能增强吞噬细胞对该菌的吞噬杀菌作用^〔2,3〕。关于沙门菌SOD与其毒力的关系目前未见报道。本研究制备了兔抗伤寒沙门菌(Stw1) Fe-SOD血清，并对其免疫保护作用进行了研究。

材料和方法

动物和菌株：新西兰白兔、昆明种小鼠均由广东医学院实验动物中心提供；4株野生型伤寒沙门菌（分别简称为Stw1、Stw2、Stw3和Stw4，抗原类型均为O9ViHd）。伤寒沙门菌H901（简称为H901）、疫苗候选株（ty21a）及鼠伤寒沙门菌毒力株（Stm，抗原类型为O4.5.12Hi.1.2）均由贵阳医学院免疫学教研室唐俊杰教授赠送。

仪器和试剂：DG3022酶标仪（国营华东电子管厂）；伤寒沙门菌Fe-SOD（Stw1 Fe-SOD，由贵阳医学院免疫学教研室提取，比活性为3270U/mg）^〔7〕；抗伤寒沙门菌O901血清（本室自制，凝集效价为1∶2560）；牛红细胞SOD（Sigma，比活性为3000U/mg）；卡介苗（兰州生物制品研究所），羊抗兔IgG酶标抗体（北京生物制品研究所）等。

抗Stw1 Fe-SOD血清的制备：将纯化的Stw1 Fe-SOD加弗氏完全佐剂免疫家兔，制备兔抗Fe-SOD血清。用ELISA法检测抗血清效价，免疫电泳法检测抗血清纯度。

抗血清特异性鉴定：用纯化的Fe-SOD和牛红细胞SOD与抗Fe-SOD血清作双向琼脂扩散试验。

抗血清对不同来源SOD活性的抑制作用：先对抗血清的浓度进行选择。取含1U SOD不同细菌无细胞溶解物及1U牛红细胞SOD加入经选定浓度的抗血清量，37℃作用30min后按NBT还原法检测SOD活性^〔8〕，并计算其抑制率^〔4〕。

抗Fe-SOD血清对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭Stw1的影响：取小鼠腹腔吞噬细胞，用Hanks液稀释至2×10⁶个/ml。用分光光度法测定细菌浓度。参照文献〔2,9,10〕方法检测抗Fe-SOD血清对小鼠腹腔吞噬细胞杀灭Stw1的影响。实验分3组，称为实验组1、实验组2和实验组3，分别取0.5、1.0和2.0ml兔抗Stw1 Fe-SOD血清，每组各加入8×10⁶CFU的Stw1和0.05ml新鲜鼠血清，并用Hanks液补足少加的抗体量，混匀，置37℃ 30min后，各加入2×10⁶个小鼠腹腔吞噬细胞，充分混匀，然后分成5管。从其中1管取0.1ml加入0.9ml无菌蒸馏水室温10min溶解细胞并作适当稀释，用倾注平板法检测CFU值，其余各管放37℃，并以第一管加入蒸馏水时作为0时刻，分别在15、30、60、120min取出一管检测CFU值，一式3份。此外设立4个对照组（分别称为对照组1、2、3、4）。其中对照组1不含吞噬细胞，对照组2不含鼠血清（抗血清浓度同实验组3），对照组3不含抗血清和鼠血清，对照组4用正常兔血清代替抗血清。并将上述实验重复做1次，共一式6份。以CFU的均值作为不同时刻的细菌存活数。

统计学处理：计量资料用±s表示，采用SPSSV6.0统计软件包进行处理，组间比较用F方差分析。计数资料采用四格表的确切概率法进行计算。

结果

1.抗血清的效价和纯度：抗血清的ELISA效价为1∶10240，经免疫电泳后兔抗Stw1 Fe-SOD血清与纯化的Stw1 Fe-SOD及Stw1无细胞溶解物在相同位置均只形成一条沉淀线（图1）。

图1免疫电泳结果

Fig 1. Result of immunoelectrophoresis

a. Purified Stw1 Fe-SOD; b. Cell-free extracts of Stw1; c. Rabbit anti-Stw1 Fe-SOD

2.双向琼脂扩散试验结果：图2显示抗Fe-SOD血清只与纯化的Stw1 Fe-SOD形成沉淀线，与牛红细胞SOD之间不形成沉淀线。

图2双向琼脂扩散试验结果

Fig 2. Result of double agar diffusion

a. Purified Stw1 Fe-SOD; b. Bovine erythrocyte SOD; c. Rabbit anti-Stw1 Fe-SOD

3.兔抗Stw1 Fe-SOD血清对不同来源SOD活性的抑制作用：图3显示,当抗血清浓度为50 ELISA单位时对1U Stw1 Fe-SOD的抑制率已达高峰，故选择50 ELISA单位作活性抑制试验。表1表示50 ELISA单位的兔抗Fe-SOD血清对1U不同来源的SOD活性的抑制率。可见抗血清对不同株伤寒沙门菌1U SOD活性的抑制率差异无显著性，对Stm SOD活性的抑制率低于伤寒沙门菌（P＜0.05），对