【 摘要 】目的编码5C5分化抗原全长cDNA的克隆及功能探索。 方法构建人活化B细胞株3D5细胞的λgt11 cDNA文库，以核苷酸杂交法从cDNA文库中筛选阳性克隆，作核苷酸序列分析，编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析，Northern blot测5C5 mRNA转录本长度，用RT-PCR检测5C5 mRNA在不同细胞株的表达，观察单抗5C5-G1对3D5细胞增殖的影响。 结果从人活化B细胞株3D5的λgt11 cDNA文库筛选到长905bp的5C5-1 cDNA及754bp的5C5-2 cDNA。5C5-1 cDNA序列内有1个开放阅读框架(19～537bp)，编码179个aa的蛋白质。此蛋白质内有一穿膜螺旋结构（94～114aa）, 其N端在胞内。5C5-2 cDNA从163到459为开放阅读框架，编码99个aa的蛋白质。从Northern blot见0.9kb左右和0.7kb左右2条杂交带。由RT-PCR见5C5 mRNA在3D5细胞强表达，在Daudi细胞表达次之，在Jurkat细胞表达最弱。单抗5C5-G1有增强cpBCGF诱导3D5细胞增殖的作用。 结论长905bp的5C5-1 cDNA为1个全长cDNA。编码1个膜蛋白，可能参与3D5细胞的增殖反应。

Cloning and sequencing of the cDNA encoding a

human differentiation antigen

MA Fengrong, YAN Min, MENG Xiaoyan, et al. Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences, and Basic Medical College, Peking Union Medical College, Beijing 100005, P.R.China

【 Abstract 】ObjectiveCloning and sequencing of the cDNA encoding a differentiation antigen 5C5. MethodsConstruction of a λgt11 cDNA library of 3D5 cells, a human activated B cell line; isolation of positive cDNA clones from the cDNA library with phage hybridization; sequencing of the cDNA; open reading frame analysis; hydrophobic analysis of the amino acid sequence of the deduced protein; determination of the length of 5C5 mRNA transcript with Northern blot hybridization test; determination of 5C5 mRNA transcription in various cell lines with RT-PCR. Results5C5-1 cDNA (0.9kb) and 5C5-2 cDNA (0.7kb) have been isolated from a λgt11 cDNA library of 3D5 cell, a human activated B cell line, by using a 467bp 5C5 cDNA as a probe. Nucleotide sequence analysis has shown that the 5C5-1 cDNA is 905bp long with an open reading frame (ORF) from 19 to 555bp in it. The TopPred 2 topology prediction of the membrane protein suggests that the 179aa protein deduced from the ORF has a helix membrane-spanning segment from 94 to 114aa. The orientation is that the N-terminal is inside the cell. 5C5-2 cDNA is 754bp long with an ORF from 163 to 459bp encoding a protein with a length of 99aa. Northern blotting shows two mRNA transcripts with lengths of 0.9kb and 0.7kb respectively, indicating that the 905bp cDNA is a full-length cDNA. RT-PCR reveals strong, medium and weak expressions of 5C5 mRNA in 3D5 cell, Daudi cell and Jurkat cell respectively. ConclusionThe 905bp 5C5-1 cDNA is a full-length cDNA encoding a human membrane protein.

【 Subject words 】5C5 cDNA; Leucine-zipper protein; B lymphocyte; Differentiation antigen

我们曾报道，用抗人活化B细胞株3D5的单克隆抗体5C5^〔1〕和5C5-G1^〔2〕的混合物，从人扁桃体细胞λgt11 cDNA文库(ATCC, Cat No:37545)筛选到1个长613bp的cDNA^〔3〕。由于其长度与以往作的Northern blot检测结果不符，我们以已克隆到的cDNA作探针，从相应cDNA文库再作克隆。从所构建的3D5细胞λgt11 cDNA文库，克隆到905bp(5C5-1)和754bp(5C5-2)长的2个cDNA。在5C5-1 cDNA中有一个开放阅读框架（19～555bp），编码179个氨基酸(aa)的膜蛋白。在5C5-2 cDNA中有一个长297bp(163～459bp)的开放阅读框架，编码99个aa的蛋白质。单抗5C5-G1有增强BCGF（B细胞生长因子）诱导3D5细胞增殖的作用。

材料与方法

细胞与菌株：人活化B细胞株由本室建立^〔4〕。人Burkitt淋巴瘤细胞株Daudi及人T淋巴瘤细胞株Jurkat冻存于本室。所有细胞均于含10%初生牛血清、2mmol/L 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中培养传代。大肠杆菌Y1090和DH5α为本室保存。

工具酶、试剂盒及同位素：限制性内切酶购自Promega公司及GIBCO公司。T4 DNA连接酶、Klenow大片段酶、M-MLV逆转录酶等购自Boehringer Mannheim公司。RNase A、DNase Ⅰ及蛋白酶购自华美生物制品公司。总RNA提取试剂盒、mRNA提取试剂盒、随机引物标记试剂盒及λ噬菌体包装蛋白购自Promega公司。cDNA合成试剂盒购自Pharmacia公司。小量胶回收试剂盒产自上海华顺生物试剂公司。α-³²P-dCTP购自北京亚辉生物医学工程公司。低分子质量BCGF由本实验室制备^〔5〕。

3D5细胞λgt11 cDNA文库的构建：收集生长状态良好的3D5细胞约10⁸，用PBS于4℃离心洗涤1次，按总RNA提取试剂盒说明提取总RNA。mRNA的分离纯化、cDNA一、二链的合成，双链cDNA末端EcoRⅠ接头的连接及双链cDNA的重组与包装均按照相应试剂盒说明书操作。按1100、 11000、110000比例稀释噬菌体包装混合物，感染Y1090大肠杆菌，计算噬菌体cDNA文库滴度与cDNA文库的重组率。提取随机挑选的白色噬菌斑的重组噬菌体，用EcoRⅠ限制性内切酶消化，电泳鉴定插入片段大小。扩增cDNA文库，加入终浓度为7%的二甲基亚砜，储存于-70℃。具体方法参照“Molecular Cloning”^〔6〕。

3D5细胞λgt11 cDNA文库筛选：探针按Promega公司随机引物标记试剂盒操作说明标记α³²P-dCTP。筛选方法参照“Molecular Cloning”。将λ噬菌体噬斑固定于尼龙膜(GIBCO BRL)。杂交，洗膜后压片，于-70℃曝光24～48小时。按照X光片上阳性点的位置寻找阳性噬斑。挑取阳性噬斑，置于SM液中扩增噬菌体。连续几轮筛选，直至平板上噬斑全部阳性。

阳性λ噬菌体克隆DNA的提取及DNA核苷酸序列测定：参照“Molecular Cloning”介绍的方法提取阳性重组噬菌体DNA。用EcoRⅠ酶小量酶切消化。电泳观察阳性克隆插入片段大小。挑取不同大小插入片段，插入pGEM-3Z（+）质粒。扩增及提取质粒。在美国PE公司生产的377型DNA测序自动分析仪上，用荧光标记引物循环测序法行测序反应。

cDNA核苷酸序列与其编码蛋白质氨基酸序列的计算机分析：用DNAsis软件分析cDNA序列中的开放阅读框架。用Prosis蛋白分析软件对所演绎的蛋白质作亲疏水分析。从Internet网上以blast方式与GenBank数据库资料比较所得蛋白质氨基酸序列的同源性。用TMpred软件预测蛋白质的穿膜区。用MotifFinder软件预测5C5蛋白质中的基本序列（motif）。

Northern blot杂交分析：取所提的3D5细胞RNA，行RNA甲醛变性凝胶电泳。将凝胶中的RNA转印至尼龙膜。室温晾干（30min）后，置于两张滤纸间，于真空干燥器中80℃烘干2h。以α³²P-dCTP标记的467bp 5C5 cDNA作探针行Northern杂交。杂交尼龙膜洗涤后用滤纸吸干，保鲜膜包裹，-70℃压片显影。数天后冲洗X光片。方法参照“Molecular Cloning”。

RT-PCR：提取3D5细胞、Daudi细胞和Jurkat细胞的总RNA。依测得的5C5 cDNA核苷酸序列合成上下游引物（上游引物1：5′GGA TAA CGC CCC CAA GGA G3′，下游引物1：5′CTT TGG CGA CAT TGG CTT TG 3′；上游引物2：5′ACC TCG TCC AGG CAA AGA AGC 3′；下游引物2：5′ATT CTC CCA AAC GGC TCC AC 3′），并合成β-actin上下游引物5′GAT GAT ATC GCC GCG CT 3′和5′TGG GTC ATC TTC TCG CGG TT 3′。向经DEPC水处理的Eppendorf管中加入DEPC水15μl、5×反转录酶缓冲液6μl、dNTP (10mmol/L) 1μl、poly T16 (50μmol/L)1μl、寡聚六核苷酸1μl与总RNA 1.5μg。混匀后置65℃水浴10min以变性RNA。置冰浴2min，转入42℃ 10min，再加入RNasin(10U/μl) 0.5μl、100mmol/L DTT 3μl与鼠源性反转录酶M-MLV (200U/μl)1μl，混匀。于42℃水浴90min后行PCR扩增。依次加入纯净水35μl、10×Taq缓冲液5μl、dNTP (10mmol/L)4μl、上游引物1（10μmol/L）1μl（或上游引物2）、下游引物1（10μmol/L）2μl（或下游引物2）、25mmol/L MgCl₂ 2μl及Taq酶4U。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃～60℃退火45s（依引物中G+C含量不同而改变退火温度），72℃延伸1min，循环35次，最后再72℃延伸5min。取10μl PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪观察结果。设β-actin为内参照。

3D5细胞的增殖： 用RPMI 1640液离心洗涤3D5细胞2次，并用此液重悬3D5细胞，密度为10⁶/ml。加1ml细胞悬液于50ml无菌离心管内，1500r/min离心50min，弃上清。然后分别加入100μl用RPMI 1640稀释的5% 5C5-G1单抗腹水，或5% Sp2/0腹水，或RPMI 1640，置冰浴1h。用RPMI1640液1500r/min离心洗涤细胞1次。再用RPMI 1640液重悬细胞，密度为2.5×10⁴/ml。向96孔板加180μl细胞悬液。每孔各加10μl BCGF（终浓度为5%），对照孔加10μl RPMI 1640。37℃ 5% CO₂孵箱中培养24h，收获前8h加³H-TdR，每孔18.5kBq(0.5 μCi)