【 摘要 】目的在大肠杆菌中表达重组人IL-18（rhIL-18）及rhIL-18-绿色荧光蛋白 (GFP)融合蛋白并测定其生物活性。方法构建原核表达质粒pET28a/hIL-18及pTrc99/hIL-18-GFP，并分别转化大肠杆菌BL21。用IPTG诱导重组蛋白的表达，超声裂菌上清中的rhIL-18用镍金属螯合层析柱进行纯化，rhIL-18-GFP用抗GFP亲和层析柱及Sephacryl S-100分子筛柱纯化。以人的外周血单核淋巴细胞测定两重组蛋白的生物活性。结果表达的rhIL-18及rhIL-18-GFP均具有促进T细胞增殖，增强NK细胞细胞毒作用及诱导外周血单核淋巴细胞合成IFN-γ的能力, rhIL-18-GFP还具有GFP的绿色荧光特性, 可对P815细胞进行标记。结论表达并纯化的rhIL-18及rhIL-18-GFP具有生物活性，可用于进一步的功能研究。

Expression and analysis of recombinant human IL-18 and human IL-18-GFP fusion proteinHU Xiao^*, WANG Lifeng, LU Ping, et al. ^*Department of Immunology, Beijing Medical University , Beijing 100083

【 Abstract 】ObjectiveInterleukin 18 (IL-18), also known as IFN-γ-inducing factor, shares certain functional properties with IL-12. To study the biologic activities and receptor distribution of recombinant human IL-18 and IL-18-GFP fusion protein expressed in E. coli.MethodsTwo prokaryotic expression plasmids, pET28a/hIL-18 and pTrc99/hIL-18-GFP have been constructed to express the recombinant human IL-18 (rhIL-18) and its fusion protein with green fluorescent protein (GFP) in E. coli BL21, respectively. rhIL-18 was tagged with six histidine residues at its C terminus and was purified by nickel chelation chromatography. rhIL-18-GFP was purified with anti-GFP affinity chromatography and gel filtration. Biological activities were assayed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC).ResultsPreliminary studies showed that rhIL-18-GFP as well as rhIL-18 augmented T cell proliferation and IFN-γ production by ConA-stimulated human PBMCs, and enhanced NK cell cytotoxicity. In addition, rhIL-18,GFP has shown specific binding to P815 cells and the stained cells could be analyzed with flow cytometry.ConclusionsThe rhIL-18 and rhIL-18-GFP we prepared are functional and can be applied to further studies on human IL-18.

【 Subject words 】Interleukin 18Green fluorescent protein Fusion protein

白细胞介素18 (IL-18 ) , 又称IFN-γ诱导因子 (IGIF), 是最近发现的一种细胞因子,主要由活化的巨噬细胞产生。其生物学活性与IL-12相似，能促进T细胞增殖，诱导T细胞分泌IFN-γ、GM-CSF，抑制IL-4和IL-10产生，增强NK及T_H1细胞的细胞毒活性等；IL-18的表达还与自身免疫病、肿瘤及感染有关^〔1，2〕。绿色荧光蛋白 (GFP) 来源于发光生物——维多利亚水母，由238个氨基酸残基组成，经490nm波长激光激发发出绿色荧光，其激发光及发射光光谱与异硫氰酸荧光素(FITC)很接近，GFP作为分子标签已广泛地应用于分子及细胞生物学的研究 ^〔3〕 。

我们构建了人IL-18（hIL-18）及hIL-18与GFP的融合蛋白 (hIL-18-GFP) 原核表达质粒，并在大肠杆菌中获得表达。经镍金属螯合层析纯化rhIL-18，经抗GFP亲和层析及Sephacryl S-100分子筛层析纯化rhIL-18-GFP后，用人的外周血单核淋巴细胞（PBMC）测定了纯化的重组蛋白生物活性。

材料与方法

1.质粒、引物及表达质粒的构建：原核表达质粒pET28a和pTrc99均购自Novagen公司，GFP表达质粒由英国帝国理工医学院L.Barber博士惠赠。构建hIL-18表达质粒所用5＇和3＇端引物分别为：5＇-gttcaacctggaatcagattac-3＇和5＇-cccgggatcctaatcatgatgatgatgatgggggtcttcgttgt-3＇。构建rhIL-18-GFP表达质粒的引物共有两对：(a) 5＇-ccatgggcaagcttgaatcta-3＇(IL-18 5端引物)；(b) 5＇-gacaagttttgcttctgcccggcccc-3＇(IL-18 3＇端引物) 和 (c) 5＇-aacgaagacgggccggggccctctag-3＇(GFP 5＇ 端引物)； (d) 5＇-cttatttgtatagttcatc-3＇(GFP 3＇端引物)。引物 (b) 的3＇端18个碱基与GFP 5＇端引物 ( c ) 互补; 引物 (c) 的5＇ 端9个碱基 与IL-18之3＇端互补。IL-18与GFP相接处加入Gly-Pro-Gly 3个氨基酸残基linker。在引物 (a) 和 (d) 上分别设计了限制性内切酶位点以便克隆。

抽取健康人外周静脉血分离PBMC，提取总RNA，以oligo dT为引物进行RT-PCR得到cDNA。以该cDNA为模板用相应引物扩增IL-18 cDNA,并将所得PCR产物克隆于pET28a，构建成表达质粒pET28a/hIL-18。 通过三步PCR法获得编码IL-18-GFP融合蛋白的DNA片段。方法为：以IL-18 cDNA为模板，用引物 (a) 和 (b) 进行PCR扩增编码IL-18第37～193位氨基酸残基的cDNA片段， 电泳纯化第一步PCR产物。第二步,以表达GFP的质粒为模板，用引物 (c) 和 (d) 扩增编码GFP的DNA片段并纯化第二步PCR产物。第三步将第一步和第二步PCR产物混合作为模板，用引物 (a) 和 (d) 进行扩增得到编码IL-18-GFP融合蛋白的DNA片段。电泳回收此PCR产物，酶切后克隆于表达质粒pTrc99之中，构建成pTrc99/hIL-18-GFP。构建的表达质粒示意图见图1。

图1pET28a/hIL-18及pTrc99/hIL-18-GFP质粒构建

Fig 1. Construction of expression plasmid pET28a/hIL-18 and pTrc99/hIL-18-GFP

2. 菌株及细胞:所用表达菌株为E.coli BL21 (DE3)。外周血单核淋巴细胞用健康人外周静脉血经Ficoll-Hypaque（上海生化试剂厂）分离制备。人白血病细胞株K562及鼠肥大细胞瘤细胞株P815，用完全RPMI 1640-10％FCS培养基培养。

3. 试剂:ConA 、OPD、PMS、NBT、NAD、dNTP购自Sigma公司,Taq酶、T4连接酶、各种限制性内切酶购自Promega公司，IPTG购自Boehringer Mannheim公司，rhIFN-γ, 鼠抗人IFN-γ单抗（NIB42）及生物素标记的鼠抗人IFN-γ单抗 (4S.BS) 购自Pharmingen公司， 辣根过氧化物酶（HRP）标记链亲和素购自DAKO公司， rhIL-2由北京医科大学分子免疫室提供，His Bind Resin螯合层析填料购自Novagen公司，Sephacryl S-100及溴化氢活化的Sepharose CL4B购自Pharmacia公司。

4.重组蛋白的诱导表达:感受态细胞制备及质粒转化按常规CaCl₂法^〔4〕，转化后细菌用含相应抗生素的LB平皿筛选。挑取转化平皿上的单菌落接种于加有相应抗生素的LB培养基中。经37℃摇床培养扩增至吸光度A600为0.3～0.4时, 加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，30℃诱导表达12～18小时，离心收集细胞，15% SDS-PAGE分析。

5.rhIL-18的纯化:经诱导表达后的细菌用超声缓冲液(5mmol/L咪唑,0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl，pH7.9 ) 重悬后超声裂解菌体, 10000r/min离心10分钟, 收集上清,采用NiSO₄饱和的His Bind Resin纯化。洗脱蛋白经TBS(pH7.4 )透析脱盐，用于纯度及活性分析。

6.rhIL-18-GFP纯化:经诱导表达后的细菌用TBS(pH8.0)缓冲液重悬后超声裂解菌体,10000r/min离心10分钟,上清与偶联抗GFP多抗的Sepharose CL-4B亲和层析填料混匀, 4℃结合1小时后, 装柱用TBS(pH8.0)缓冲液充分洗去不结合的杂蛋白后,再用盐酸-甘氨酸缓冲液(pH3.0)洗脱与抗体结合的蛋白。收集的洗脱蛋白用TBS(pH8.0)缓冲液透析平衡后上样于Sephacryl S-100分子筛层析柱, 用TBS (pH8.0) 缓冲液洗脱。SDS-PAGE分析分子筛层析洗脱各峰的成分。

7. 热原质的去除:热原质去除采用亲和填料Polymyxin B Sepharose 4B^〔5〕， 热原测定采用鲎试剂（厦门鲎试剂厂）。

8.PBMC增殖试验:在96孔板上用完全RPMI 1640-10% FCS培养基按10倍稀释法稀释两组rhIL-18、rhIL-18-GFP和GFP，每个稀释度3个平行孔。分离的PBMC用完全RPMI 1640-10% FCS培养基配成4×10⁶细胞/ml, 分成两份, 对应稀释好的两组rhIL-18、rhIL-18-GFP和GFP，其中一份加入终浓度为0.05μg/ml的ConA。 在已稀释好的96孔板中每孔加入细胞100μl, 37℃ 5％CO₂孵箱培养72小时，最后8小时每孔加入³H-TdR 0.5μCi(18.5kBq)。收获细胞，用β液闪计数器测cpm值。

9.IFN-γ诱导合成试验:在96孔板上用完全RPMI 1640-10% FCS培养基按10倍稀释法稀释两组rhIL-18、 rhIL-18-GFP和GFP，每个稀释度3个平行孔。分离的PBM