【 摘要 】目的探讨HLA-DR⁺嗜酸性粒细胞（EOS）在体外培养条件下作为抗原呈递细胞（APC）将破伤风类毒素抗原（TT）呈递给T淋巴细胞的能力。方法新分离的EOS经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子刺激24小时，以诱导HLA-DR的表达，然后将其暴露于不同浓度的TT，检测HLA-DR⁺EOS对自身T细胞增殖反应的影响，以评价EOS呈递抗原的能力。结果HLA-DR⁺EOS于TT存在时可以明显促进T细胞的增殖反应，并与TT的浓度呈剂量相关性。而抗HLA-DR单克隆抗体则可以明显地抑制EOS的抗原呈递过程。结论人EOS可以摄入和处理抗原并能将其传递给自身T细胞，而EOS呈递抗原的过程具有明显的HLA-DR依赖性。

Eosinophils function as antigen-presenting cells SHI Huanzhong, JIANG Haixing. Department of InternalMedicine, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021

【 Abstract 】ObjectiveTo examine the capacity of HLA-DR expressing eosinophils to serve as antigen-presenting cells (APC) for presenting antigen tetanus toxoid to autologous T lymphocytes.Methods Freshly isolated eosinophils were cultured in vitro for 24 hours with granulocyte-macrophage colony factor to induce HLA-DR expression, and then exposed to different concentrations of tetanus toxoid. The capacity of HLA-DR⁺ eosinophils to function as APC was evaluated with the response of T cell proliferation induced by eosinophils.ResultsHLA-DR⁺eosinophils stimulated T cell proliferation in the presence of tetanus toxoid in a dose-dependent manner. It was also found that the T cell proliferation response elicited by eosinophils was inhibited by anti-HLA-DR monoclonal antibody.ConclusionHuman eosinophils can uptake and process antigen and function as HLA-DR-dependent APC in stimulating T lymphocyte response.

【 Subject words 】EosinophilsAntigen-presenting cellLymphocyte

嗜酸性粒细胞（EOS）作为变态反应主要效应细胞，一般认为其功能与其所产生和释放的化学性递质、颗粒相关蛋白和某些细胞因子有关。然而，自从发现成熟EOS具有表达Ⅱ类主要组织相容性复合体基因（MHC）所编码的HLA-DR蛋白^〔1〕的能力以来，EOS 作为抗原呈递细胞（APC）的研究日益受到重视。本研究观察了EOS在体外培养条件下将破伤风类毒素抗原（TT）呈递给自身T淋巴细胞的能力。

材料与方法

1.EOS分离：为分离纯化的EOS，240ml枸橼酸盐抗凝的静脉血取自3名健康志愿者和3例对花粉或粉尘螨过敏的患者，每50ml枸橼酸盐抗凝的静脉血与10ml 6%的葡聚糖混匀后直接于60ml的注射器内倒立静置45分钟，收集富含白细胞的血浆，缓缓置于Ficoll-Hypaque（购自瑞典Pharmacia公司）之上，室温下250×g离心20分钟。收集沉积于管底的粒细胞和红细胞于另一50ml之离心管，加入10ml 0.2%氯化钠溶液，将红细胞溶解后再加等体积1.5%氯化钠溶液至等渗。粒细胞则与CD16、CD14和CD3微珠（均购自美国Miltenyi Biotec公司）4℃下孵化30分钟后，经MACS分离柱（美国Miltenyi Biotec公司产品）剔除CD16⁺中性粒细胞和少量残存的CD14⁺单核细胞和CD3⁺T细胞。形态学检测表明,所分离的EOS纯度均＞99%，台盼蓝排除试验表明99%以上的EOS是活细胞。为诱导EOS表达HLA-DR，新分离的EOS均于加有终浓度为100pmol/L的人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的细胞培养液（RPMI 1640辅以10%人AB型血清、2mmol/L谷氨酰胺、10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素）在5% CO₂潮湿环境中37℃培养24小时。

2.T细胞分离：为得到新鲜分离的自体T细胞，抽血分离EOS的6名志愿者均分别于次日复抽取静脉血80ml，并按上述方法收集血浆后同样缓缓置于Ficoll-Hypaque之上，室温下250×g离心30分钟。收集位于血浆与Ficoll-Hypaque之间界面的单一核细胞层，以冷Hanks缓冲液（HBSS）洗涤2次后通过CD3 T细胞分离柱（购自美国P&D System）即得到纯化的T淋巴细胞。分离方法系根据产品所附的说明书进行操作。

3.HLA-DR表达的检测：将10⁵新分离或经GM-CSF刺激的EOS悬于100μl含有牛血清蛋白（1g/L）和叠氮钠（0.1g/L）的HBSS中，分别与20μl藻红蛋白标记的抗HLA-DR单克隆抗体（单抗）和IgG2a对照蛋白(均购自于美国Becton Dickinson公司）于4℃孵化30分钟后，以同样的HBSS洗涤2次再以0.5%多聚甲醛固定。24小时内以FACStar Plus流式细胞仪及Consort软件（均为美国Becton Dickinson 公司产品）分析EOS所表达的HLA-DR。

4.EOS呈递抗原：为观察不同数量EOS在同一抗原浓度条件下刺激T细胞增殖的能力，将不同数量的（详见结果所述）的HLA-DR⁺EOS和10⁵T细胞共同置于96孔细胞培养板中，培养液同上。TT（购自美国Massachusetts Department of Public Health）终浓度为20mg/L。为观察不同剂量TT对T细胞增殖反应的影响，各孔细胞均为5×10⁴EOS和10⁵T细胞，各组TT终浓度分别为0.1mg/L、1mg/L、10mg/L和100mg/L。在部分实验中，5×10⁴EOS在和10⁵T细胞共同培养之前先与终浓度为100mg/L的抗HLA-DR单抗（购自美国American Type Curltre Collection）或IgG1对照抗体孵化2小时，以观察抗HLA-DR单克隆抗体的封闭作用。上述细胞培养板置于5% CO₂培养箱中潮湿环境下37℃培养96小时，于最后24小时每孔加入37kBq/L的³H胸苷。收获细胞后以射线液闪计数仪测定T细胞DNA合成所结合的³H胸苷量（以cpm表示），此即为T细胞的增殖能力。以上所有各项实验均3管测定，结果以均数±标准差表示。在每一个单独的实验中，如果在某种条件下所测得的cpm值等于或大于对照组（即不加入TT或EOS数为零）cpm的3倍，即认为T细胞出现增殖反应。

结果

1.HLA-DR在EOS的表达：新分离的EOS不表达或仅表达极低水平的HLA-DR蛋白(0～12.2%，平均4.8%）（图1和图2）。EOS于加有终浓度为100pmol/L的GM-CSF培养液中体外培养24小时，来自6名不同志愿者的EOS均表达较高水平的HLA-DR（25.2%～78.6%，平均49.5%）。

图1以流式细胞仪检测新分离(A)和经GM-CSF刺激(B)的嗜酸性粒细胞表达的HLA-DR结果比较

Fig 1. Flow cytometry of freshly isolated eosinophils (A) and GM-CSF-treated eosinophils (B)

Thin line:Control IgG2a;Thick line:Anti-HLA-DR monoclonal antibody

图26名志愿者嗜酸性粒细胞经GM-CSF刺激前后表达HLA-DR结果比较

Fig 2. HLA-DR expression on eosinophils obtained from six donors before and after gM-CSF stimulation

2.不同EOS细胞数对呈递抗原的影响：从图3可以看出，仅加入TT而不加EOS时，T细胞并无增殖反应；EOS数增至10⁴时，T淋巴细胞仍不出现增殖反应，亦即如此低数量的EOS并不能将TT呈递给T细胞。当EOS数增至2.5×10⁴时，即可观察到T细胞所结合的³H胸苷明显增多，至5×10⁴和10⁵时，T细胞呈现更明显的增殖反应。图3表示6次独立实验中的1次结果，其余5次实验结果与此相同。

图3不同数量HLA-DR阳性嗜酸性粒细胞呈递抗原能力比较

Fig 3. Efficiency of different numbers of HLA-DR positive eosinophils as antigen-presenting cells

3.不同剂量抗原对T细胞增殖的影响：图4代表结果相同的6次独立实验中的1次结果。可以看出，EOS将TT呈递给T细胞的能力与TT浓度密切相关。当TT的剂量低至0.1mg/L时，所测得的cpm值极低，实际上为背景值；TT的浓度增至1mg/L时，cpm值开始升高；当TT的浓度增至10mg/L和100mg/L时，cpm值则显著升高。

图4不同浓度抗原对自身T细胞增殖反应的影响

Fig 4. Effects of different doses of antigen tetanus toxoid on autologous T lymphocyte proliferation response

4.HLA-DR和抗原呈递之间的关系： 当考察HLA-DR表达与EOS呈递抗原之间的关系时，我们注意到，来自6名志愿者新分离纯化的EOS，由于不表达或仅表达极低水平的HLA-DR而均不能将TT呈递给T细胞。经GM-CSF刺激24小时后，<