【 摘要 】目的研究在中枢神经系统(CNS)的炎症性疾病中，作为构成血脑屏障结构的组成部分之一，可引起白细胞浸润的星形细胞分泌趋化因子的影响因素。方法通过星形细胞体外培养，经不同细胞因子刺激，用原位杂交检测成年大鼠星形细胞β-家系趋化因子的mRNA表达。结果IFN-γ可引起MCP-1，RANTES，MIP-1α和MIP-1β的mRNA表达；TNF-α可引起RANTES和MIP-1β的mRNA表达；LPS可引起MIP-1α和MIP-1β的mRNA表达。TGF-β和IL-10下调由LPS引起的MCP-1和MIP-1α和MIP-1β mRNA表达。TGF-β和IL-10可抑制由TNF-α引起的MCP-1和RANTES的mRNA表达。IL-10还可下调由TNF-α引起的MIP-1β mRNA表达。结论成年大鼠体外试验中的星形细胞可由LPS和前炎症因子刺激，产生β-家系趋化因子mRNA的表达。而调节因子如TGF-β和IL-10可抑制由IFN-γ、TNF-α和LPS引起的β-家系趋化因子的mRNA表达。

Secretion of β-chemokine from the adult rat astrocytes stimulated by LPS, proinflammatory cytokines and immunoregulatory cytokinesGUO Hong^*, JIN Yuxuan, XU Xianhao, et al. ^*Department of Neurology, Beijing Hospital, Ministry of Health, Beijing 100730

【 Abstract 】ObjectiveTo investigate factor(s) regulating astrocyte chemokine expression, we examined the induction of β-chemokine mRNA expression in adult rat astrocytes.MethodsBy in situ hybridization, we determined the β-family chemokine mRNA expression in the astrocytes which were cultivated in vitro and stimulated with different agents.ResultsAstrocyte-derived MCP-1, RANTES, MIP-1α and MIP-1β mRNA were easily induced by IFN-γ. TNF-α induced RANTES and MIP-1β mRNA expression, and LPS induced MIP-1α and MIP-1β mRNA expression in astrocytes. LPS-induced MCP-1 and RANTES mRNA expression by astrocytes were antagonized by TGF-β and IL-10. TGF-β and IL-10 also down-regulated MCP-1 mRNA expression induced by TNF-α, and IL-10, but not TGF-β, inhibited MIP-1β mRNA expression induced by TNF-α.ConclusionsThe results of this in vitro study suggest that β-chemokine mRNA expression by adult rat astrocytes can be induced by LPS or proinflammatory cytokines, while regulatory cytokines, such as TGF-β and IL-10, down-regulate the induction of astrocyte-derived β-family chemokine mRNA expression induced by LPS, IFN-γ and TNF-α.

【 Subject words 】AstrocyteChemokineCytokine

在中枢神经系统(CNS)内部，只有极少量的T细胞存在，在脑损伤、脓肿和多发性硬化(MS)及其动物模型(急性变态反应性脑脊髓炎，EAE)等疾病中，炎症细胞被吸引进入CNS，是病理和防御过程产生和发展的关键。

星形细胞是组成血脑屏障(BBB)的胶质细胞，在CNS内起着多种作用。以往资料显示，在CNS的自身免疫性疾病、炎症性疾病和急性损伤中，BBB内星形细胞分泌的趋化因子参与了对外周血单核细胞和T淋巴细胞的吸引过程^〔1-3〕。

体外试验还发现LPS，TNF-α，IFN-γ,IL-1β可引起星形细胞分泌趋化因子^〔4，5〕。但大部分研究集中于人胚胎和新生鼠的星形细胞，较少关于成年大鼠星形细胞趋化因子分泌和调节情况的报道。

我们观察了成年大鼠星形细胞经LPS，前炎症因子(TNF-α和IFN-γ)和免疫调节因子(TGF-β和IL-10)作用后趋化因子的mRNA表达情况。主要包括：1.单核细胞化学趋化蛋白质(MCP-1)；2.RANTES(regulated upon activation,normal T cells,expressed and secreted)。3.巨噬细胞感染蛋白质-1α(MIP-1α)；4.巨噬细胞感染蛋白质-1β(MIP-1β)。

材料与方法

1.材料：大鼠重组IFN-γ，大鼠重组TNF-α由P.vander Meide博士惠赠(TNO Primate Center,Rijswijk,the Netherlands)。人重组IL-10(人重组IL-10对大鼠、小鼠和人的靶细胞均有活性，和大鼠IL-10有80%的同源性)由Schering Plough Research Institute，Kenjilworth NJ惠赠。人重组TGF-β(和大鼠重组TGF-β有90%的同源性)由美国Genetech,Inc.San Francisco,CA惠赠。LPS从Sigma公司购买。

2.星形细胞培养：取6～8周Lewis大鼠脑，机械研碎，用Dulbeeco修改的Eagle液(Gibco,Paisleg,UK),〔加入2mmol/L谷酰胺(Flow,Irvine,UK),10%灭活的胎牛血清(Gibco),50IU/ml青霉素和50μg/ml链霉素(Gibco,Paisley,UK),体积数分别为1%的MEM氨基酸(Gibco)和10mmol/L Hepes(Sigma)〕洗涤，并制成10⁶/ml的细胞悬液放入75cm²的培养盒中培养(37℃，5%CO₂)。2～3小时后，破碎的髓鞘成分和未附壁的细胞经过100r/min,1～2分钟摇动去除后再培养2周(每周更换一次培养液)，在75cm²培养盒中的单层星形细胞最后摇动100r/min,24小时用以去除寡树突细胞。

3.用LPS和细胞因子刺激：将星形细胞制成1.5×10⁴/ml浓度的悬液，放在24孔培养板中(Costar,Canbridge,MA)分别加入LPS(10μg/ml)，IFN-γ(10U/ml),TNF-α(100U/ml),IL-10(100ng/ml),TGF-β(100ng/ml)以及PBS于37℃，5%CO₂培养24小时后，收集细胞，并用DEPC处理过的PBS洗涤3次，之后制成10⁵/ml浓度的细胞悬液，点10μl于载玻片上(probe on slides, Fisher Scientific,Pittsburgh,PA),细胞在55℃烤干10分钟后密封于盒中保存在-20℃待用。

4.用原位杂交方法检测趋化因子的mRNA表达：MCP-1，RANTES，MIP-1α和MIP-1β的寡核苷酸探针购自R&D(R&D Systems Europe,Abingdon,UK),用³⁵S(Dupont Scandinavia,Stockholm, Sweden)标记探针，细胞于42℃用杂交液杂交18小时，在放射自显影后，显影、定影，最后晾干，在放大20倍显微镜(暗视野)下计数阳性细胞(每个细胞包含超过15个亮点的细胞定为阳性细胞)。以上资料为双盲获得。

5.统计学分析：资料用平均数±标准差显示，各组间相互比较用双尾学生t检验，3组与同一组比较用单尾学生t检验，统计学意义用*表示：*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。

结果

未被刺激的成年大鼠星形细胞在体外培养2周后发现其表达MCP-1，RANTES，MIP-1α，MIP-1β的mRNA量非常低(图1A，B，C和D)。

图1成年大鼠星形细胞经IFN-γ、TNF-α和LPS刺激表达β-趋化因子mRNA的情况

Fig 1. The β-chemokine mRNA expression of adult rat astrocytes stimulated by IFN-γ、TNF-α and LPS

IFN-γ单独可以引起MCP-1的mRNA表达，但单用TNF-α和LPS则不然。IFN-γ+LPS，IFN-γ+TNF-α以及TNF-α+LPS均可上调星形细胞表达MCP-1 mRNA。TNF-α与LPS或IFN-γ结合引起高水平MCP-1的mRNA表达(图1A)。

除LPS外，单用IFN-γ和TNF-α均可引起RANTES的mRNA表达。LPS与IFN-γ或TNF-α结合都可以增加RANTES的mRNA表达；IFN-γ单独应用可以引起很强RANTES的mRNA表达，但与TNF-α结合却引起相反的结果(图1B)。

LPS，IFN-γ以及它们相互或分别与TNF-α结合都可以引起MIP-1α及MIP-1β的mRNA表达；TNF-α单独应用不能引起MIP-1α mRNA表达，但可以引起MIP-1β mRNA表达(图1C、D)。

TGF-β和IL-10可以下调星形细胞由LPS和TNF-α引起MCP-1表达mRNA(图2A，图3A)，抑制由TNF-α引起的RANTES的mRNA表达(图3B)，TGF-β可抑制由LPS引起的MIP-1α和MIP-1β的mRNA表达(图2B、C)，IL-10还能抑制TNF-α引起的MIP-1β的mRNA表达(图3C)。

图2TGF-β和IL-10抑制由LPS引起成年大鼠星形细胞表达β-趋化因子mRNA的情况

Fig 2. TGF-β and IL-10 inhibited the β-chemokine mRNA expression of adult rat astrocytes stimulated by LPS

图3TGF-β和IL-10抑制由TNF-α引起成年大鼠星形细胞表达β-趋化因子mRNA的情况

Fig 3. TGF-β and IL-10 inhibited the β-chemokine mRNA expression of adult rat astrocytes stimulated by TNF-α

讨论

以往研究发现，在MS或EAE和病灶处有具有活性的CD4⁺T细胞和巨噬细胞的浸润，炎症细胞被吸引进入CNS是机体发生病理变化和开始防御反应的关键步骤。趋化因子是引起炎症细胞聚积的主要因素，CNS分泌的MCP-1