【 摘要 】目的研究小鼠血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)在小鼠组织及各种细胞系的表达分布与诱导，及其在杀伤性T细胞和LAK细胞诱导中的作用。方法应用流式细胞仪技术分析PTA1在小鼠组织及细胞系中的表达及诱导；用同种异体抗原诱导杀伤性T细胞，用IL-2诱导LAK细胞，分别研究PTA1特异性单克隆抗体对其分化的影响。结果小鼠PTA1主要在T细胞系呈诱导性表达，参与杀伤性T细胞的分化，但不参与LAK细胞的诱导。结论小鼠PTA1与人PTA1有相似的分布特点与功能，是一种进化中高度保守的白细胞分化抗原。

Distribution and function of murine platelets and T cell activation antigen 1

LI Demin, JIN Boquan, SU Li, et al. Department of Immunology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032

【 Abstract 】ObjectiveTo study the expression and function of murine platelets and T cell activation antigen 1 (PTA1), a novel leukocyte differentiation antigen initially described in human activated T cells and platelets , later in monkey and gibbon cells.Methods By using PTA1-specific McAb LeoA1, flow cytometry analysis of murine cell lines and murine mixed lymphocyte reaction (MLR) were taken.Results Flow cytometry analysis showed that murine PTA1 was expressed mainly in activated T cells, and this expression could be induced by phytohemoagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA). MLR experiment showed that LeoA1 McAb could block the induction of cytotoxic T lymphocytes (CTL) induced by alloantigen, but had no effect on the function of CTL when added at effector phase. LeoA1 had effect on neither the differentiation nor the function of lymphokine-activated killer (LAK) cells.Conclusions PTA1 is a highly conserved leukocyte differentiation antigen during evolution, and murine PTA1 is a novel mouse leukocyte differentiation antigen with the same pattern of expression and function as human PTA1.

【 Subject words 】Platelet and T cell activation antigen 1Cytotoxic lymphocyteCytotoxicityMouse

血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1, PTA1)是1997年克隆成功的一种新的白细胞分化抗原，主要表达于活化T细胞和血小板表面，参与人混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction, MLR)中杀伤性T细胞(cytotoxic T cell, CTL)的分化和血小板的活化聚集^〔1〕。PTA1在结构上属于免疫球蛋白超家族(IgSF)，胞膜外区有两个Ig V样结构域，是目前发现的仅有的具有这种结构的IgSF成员。我们的研究表明，PTA1不但表达于人，也表达于两种灵长类动物：长臂猿和恒河猴^〔2，3〕。随后的基因克隆表明，猿和猴PTA1 cDNA与人有(93～95)%的同源性，表明PTA1是一种进化中保守的白细胞分化抗原(待发表)。但目前尚不清楚PTA1是否也表达于其它哺乳动物。由于小鼠作为实验材料所具有的不可替代的优势，我们着重研究了PTA1在小鼠组织和细胞中的诱导表达，及其对CTL和淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activated killer cell, LAK)的诱导和功能的影响。

材料与方法

1. 材料：成年BALB/c和C57BL/6小鼠由第四军医大学实验动物中心提供。Na₂⁵¹CrO₄购自英国Amersham公司，PTA1特异性单抗LeoA1以及葡萄球菌毒素B(SEB)单抗腹水由本室制备。小鼠细胞系：IL-2依赖的杀伤性T淋巴瘤细胞系CTLL、胸腺瘤EL-4、T淋巴瘤YAC-1、成纤维细胞系NIH3T3、巨噬细胞系P388D、肥大细胞系P815等由本室保存。

2. 免疫荧光染色及流式细胞仪分析：取佛波酯(PMA, 50ng/ml)或植物血凝素(PHA, 3μg/ml)刺激不同时间点的细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶/ml。取50μl细胞悬液，加5μl正常鼠血清及5μl FITC标记的LeoA1 单抗或对照抗体SEB单抗。4℃孵育30分钟后，用4ml洗涤液1000r/min洗涤5分钟，最后加400μl固定液，流式细胞仪分析。

3. 混合淋巴细胞反应：无菌取BALB/c小鼠脾细胞，经⁶⁰Co照射3000Rad作为刺激细胞，用含有10%FCS的RPMI1640培养基调整细胞浓度为2×10⁶/ml，取1ml细胞悬液与相同浓度C57BL/6小鼠脾细胞悬液1ml混合。在24孔板中培养，第4天补充0.5ml培养基，第5天收获效应细胞，用P815细胞作为靶细胞，⁵¹Cr释放法测定CTL杀伤活性。

4. LAK细胞的诱导：无菌取C57BL/6小鼠脾细胞，调整细胞浓度为2.5×10⁶/ml，在24孔板中每孔加2ml细胞悬液，用500U/ml rhIL-2刺激，诱导3天后以P815细胞作为靶细胞，用⁵¹Cr释放法测定LAK细胞杀伤活性。

5.⁵¹Cr释放试验：按文献〔4〕用4小时⁵¹Cr释放试验检测MLR中诱导的CTL和IL-2诱导的LAK的杀伤活性。收获处于对数生长期的P815靶细胞，调整细胞浓度为2×10⁶/ml，取0.5ml细胞悬液，加入100μCi(3700kBq) Na₂⁵¹ CrO₄，37℃孵育2小时。洗涤后稀释至10⁵/ml，在U形板中每孔加100μl细胞悬液。按照一定的效靶比加入效应细胞，37℃孵育4小时，收获100μl上清，γ计数仪计数，按下列公式计算杀伤率：

结果

1. PTA1在小鼠胸腺、脾脏和CTLL、EL-4细胞系表达的诱导：免疫荧光染色和流式细胞仪分析发现，小鼠胸腺、脾脏细胞和EL-4细胞系在静止状态下不表达PTA1，T细胞多克隆刺激剂PHA可诱导其表达。如图1、2所示，在PHA刺激后PTA1表达阳性率随时间逐步升高，在48小时达到高峰，但平均荧光强度一般在72小时时达到最高。CTLL细胞系在静止状态下即表达高水平的PTA1，在PHA刺激下表达增强，密度增加，并随时间呈现与胸腺、脾脏和EL-4细胞相似的规律(图1)。PKC特异性刺激剂PMA也可以诱导EL-4和CTLL细胞系表达PTA1，但其效应比相同条件下PHA刺激效果为弱 (图1)。

图1PTA1在小鼠胸腺细胞、脾细胞、EL-4和CTLL细胞的表达与诱导

Fig 1. Expression and induction of PTA1 on murine thymocytes, splenocytes, EL-4 and CTLL cells

2. PTA1在小鼠其它细胞系的表达：淋巴瘤YAC-1在静止状态下即表达PTA1，PMA刺激对其表达无明显诱导作用。成纤维细胞系NIH3T3、巨噬细胞系P388D和肥大细胞系P815均无明显表达(图2)。

图2PTA1在小鼠细胞系的表达与诱导

Fig 2. Expression and induction of PTA1 on murine cell lines

3. LeoA1阻断MLR中CTL的分化：在MLR开始时加入1∶200的LeoA1腹水，可以明显抑制同种异型抗原(alloantigen)所诱导的CTL的杀伤活性，在杀伤相加入同样的LeoA1腹水对CTL的杀伤功能没有影响。对照抗体SEA不影响MLR所诱导的CTL的杀伤活性(图3)。

图3LeoA1单抗对MLR诱导的CTL的杀伤活性的影响

Fig 3. Effects of LeoA1 McAb on the cytotoxicity of MLR-induced CTL

4. LeoA1不参与LAK细胞的诱导和杀伤功能：用大剂量IL-2诱导LAK细胞过程中，分别在诱导相和效应相加入LeoA1单抗，发现其对所诱导的LAK细胞的杀伤功能均无明显影响(P＞0.05)(图4)。

图4LeoA1单抗对LAK细胞杀伤活性的影响

Fig 4. Effects of LeoA1 McAb on the cytotoxicity of LAK cells

讨论

PTA1是一种配体尚未明确的白细胞分化抗原，目前认为其功能主要是参与CTL的分化和血小板的活化聚集^〔5-7〕，但对其在造血细胞分化中作用机制的研究还有赖于基因敲除及转基因动物模型的建立。由于以前的研究只发现其表达于灵长类和人^〔2，7〕，尚不具备建立动物模型的条件。本研究发现，PTA1在小鼠造血系统，特别是在T系中也有广泛的分布，而且PTA1也参与小鼠CTL细胞的分化，这一结果以及下一步的基因克隆将为深入了解PTA1的功能打下基础。

本研究结果显示，PTA1在小鼠<