【 摘要 】目的探索点突变p53肽诱导细胞免疫应答的可能性，为其作为肽疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法人工合成小鼠点突变p53肽P_132F(LNKLFFQL，132Cys→Phe突变)，与不完全弗氏佐剂(IFA)或RIBI佐剂(RAS)混合，皮下免疫C57BL/6小鼠，分离脾细胞体外用肽再刺激，诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)，并以⁵¹Cr释放法检测其杀伤活性。结果P_132F肽加上IFA或RAS免疫小鼠，均能诱导肽特异性CD8^＋CTL；低剂量重组白细胞介素2(rIL-2)能增强肽免疫效果。结论所用突变的p53蛋白具有免疫原性，提示来源于突变p53的抗原肽有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗。

Induction of peptide-specific cytotoxic lymphocytes with a mutant p53 peptide

HUANG Lanqing, LUO Liqun, LI Moyi, et al. Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

【 Abstract 】ObjectiveTo explore the possibility of inducing cell-mediated immune response with p53 peptides.Methods A mouse mutant p53 peptide, P_132F (LNKLFFQL, with a mutation of 132Cys→Phe), was synthesized. C57BL/6 mice were subcutaneously immunized with P_132F in adjuvant IFA or RAS, and spleen cells of the primed mice were restimulated in vitro with the peptide to generate cytotoxic T lymphocytes (CTL). The cytotoxicity of the CTL was detected by ⁵¹Cr release assay.Results It was found that peptide-specific CD8⁺ CTL responses were readily elicited by immunization with P_132F mixed with either IFA or RAS, and that low dose of rIL-2 helped enhance induction of peptide-specific CTL.Conclusion The results suggest that mutant p53 protein is immunogenic and that antigenic peptides derived from the protein may be used as peptide vaccines for cancer immunotherapy.

【 Subject words 】p53 peptidesT lymphocytes，cytotoxic

人工合成抗原肽用于肿瘤免疫治疗(肽疫苗治疗)是肿瘤治疗的一个新策略，初期临床试验证明此法安全可行^〔1〕。我们先前的研究发现，小鼠突变p53肽P_132F(LNKLFFQL，132Cys→Phe突变)对MHCⅠ类分子H-2K^b具有高亲和力^〔2〕。本文报道用P_132F肽免疫小鼠，能诱导肽特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)应答。

材料和方法

1.动物：C57BL/6小鼠(H-2^b)，6～8周龄，由本所动物室提供。动物饲养和所有动物实验均在本所动物室的洁净室内进行(达Ⅱ级动物要求)。

2.RMA-S细胞：为C57BL/6小鼠来源、Rauscher病毒诱生的T细胞淋巴瘤RBL-5细胞的突变株，抗原处理相关性转运体基因2(TAP2)突变，细胞表面表达没结合上肽的MHCⅠ类分子(空载MHCⅠ类分子)，这种空载Ⅰ类分子能直接结合相应的外源肽^〔3〕。

3.试剂：不完全弗氏佐剂(IFA，Gibco BRL，美国),RIBI佐剂系统(RAS，RIBI Immuno Chem Research,Inc，美国)，重组人白细胞介素2(rIL-2，北京四环生物工程制品厂)，丝裂霉素C(MMC，日本KYOWA产品)，Na₂⁵¹CrO₄(DuPont NEN，美国)。

4.肽合成：P_132F肽(LNKLFFQL)和仙台病毒肽SEV-9(FAPGNYPAL,作为对照肽)的合成见参考文献〔2〕。

5.肽免疫、CTL诱导及其杀伤活性测定：肽与佐剂(IFA或RAS)充分混匀，给C57BL/6小鼠免疫(尾根部皮下注射，免疫剂量为100μg肽/鼠)。2周后以相同剂量加强免疫一次。7～10天后取脾(对于加用rIL-2组，加强免疫次日起，rIL-22000U/鼠，ip,连用6天，第7天取脾)，常规分离脾细胞，制成脾细胞悬液。另制备健康未免疫同系小鼠脾细胞悬液，以MMC(80μg/ml)37℃处理1小时，洗3次，再与相应肽(2μg肽/10⁶细胞)在37℃孵育2小时。将免疫鼠脾细胞(5～6)×10⁶/ml与未免疫鼠脾细胞(2～3)×10⁶/ml混合，并加入rIL-2(终浓度20U/ml)于24孔细胞培养板37℃ 5% CO₂条件下培养5天后，收获细胞，以6小时⁵¹Cr释放法测定细胞杀伤活性，靶细胞为肽标记(50μg肽/10⁶细胞)的RMA-S。标记和鉴定方法详见文献〔2〕。

6.CTL细胞表面标志检测：按间接免疫荧光法检测CTL细胞表面CD4和CD8分子，一抗分别用GK1.5和2.43，荧光标记二抗为FITC标记兔抗大鼠IgG。经COULTER EPICS EliteESP流式细胞仪(美国COULTER公司)分析5000个细胞，计算阳性率。

结果

1.P_132F肽加用不同佐剂免疫均能诱导肽特异性CTL：P_132F肽和对照肽SEV-9与IFA或RAS佐剂混合后免疫小鼠，两周后加强免疫一次，再经7～10天，取免疫鼠脾细胞体外用相应肽刺激5天。如此诱导的CTL对相应肽标记的RMA-S细胞具有特异性杀伤活性，结果见图1，图2。

图1突变p53肽加上佐剂IFA诱导肽特异性CTL应答

Fig 1. Peptide-specific CTL responses induced with mutant p53 peptide in IFA

图2突变p53肽加上佐剂RAS诱导肽特异性CTL应答

Fig 2. Peptide-specific CTL responses induced with mutant p53 peptide in RAS

2.低剂量rIL-2体内注射可以增强肽特异性CTL应答：从P_132F肽加强免疫次日起，给小鼠腹腔注射低剂量rIL-2(每天4000U/鼠)，连用6天，能明显增强CTL对P_132F肽标记的靶细胞(P_132F-pulsedRMA-S)的杀伤作用，而不增加对SEV-9-pulsedRMA-S的非特异性杀伤。不加抗原肽，单纯IFA+rIL-2作对照免疫不能诱导非特异性杀伤细胞(图3)。

图3P_132F肽加不同佐剂诱导CTL应答

Fig 3. CTL responses induced with P_132F in different adjuvants

*P＜0.001 compared with P_132F in IFA group

3.P_132F肽诱导的肽特异性CTL是CD8⁺T细胞：以流式细胞仪分析P_132F和SEV-9特异性CTL细胞表型，显示两种肽诱导的CTL都以CD8⁺T细胞为主，见图4。

图4肽特异性CTL的细胞表型

Fig 4.The phenotype of peptide-specific CTL

讨论

p53基因突变是人类肿瘤最常见的基因突变。突变的p53蛋白半衰期明显延长，在细胞核甚至细胞浆中聚集，这种结构和功能异常的p53蛋白只表达在肿瘤细胞，有可能作为肿瘤特异性抗原，成为机体免疫攻击的靶分子^〔4〕。本研究结果表明，突变p53肽能诱导有效的特异性CTL应答，有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗。

一般认为相对分子质量小的短肽免疫原性很弱，但这是就诱导抗体免疫而言。近年来的研究表明，T细胞识别的就是这种短肽，实验证明少于17个氨基酸的短肽无需经过酶降解过程，直接进入内质网而被递呈，与长的多肽比较，更容易诱导细胞免疫应答^〔5，6〕。用8～12个氨基酸的抗原肽加上传统的佐剂(如IFA)就能诱导很强的CTL应答。随着各种新型佐剂的问世，如Detox、QS-21等，肽疫苗可以很方便地应用于临床免疫。我们以小鼠突变p53肽P_132F，加上IFA或RAS(Detox)免疫，均能诱导较强的肽特异性CTL应答，说明P_132F是突变p53蛋白中的CTL识别表位。

我们的研究还发现，IL-2能明显增强肽免疫效果。IL-2作为一种重要的免疫调节因子，对T细胞的激活和扩增均具有作用。在抗原免疫后，应用低剂量IL-2可使抗原特异性CTL前体细胞(CTL precursors,CTLp)进一步激活和扩增，起到免疫放大作用，因此，IL-2可作为一种免疫佐剂因子。已有动物实验表明，低剂量IL-2能增强表达肿瘤相关抗原的重组痘苗病毒免疫治疗肿瘤和肿瘤肺转移的效果^〔7，8〕。对于本来就处于免疫抑制状态的肿瘤病人，肿瘤肽疫苗的免疫若配伍应用适当的免疫佐剂因子，才能取得更好的免疫治疗效果。确实，给肿瘤病人皮下注射低剂量IL-2，可