【 摘要 】目的用体外培养的昆明小鼠胚胎脑皮质神经元，感染汉滩病毒后，加入肾综合征出血热(HFRS)病人恢复期血清，观察病毒感染神经元后细胞的变化以及HFRS病人恢复期血清对神经元的保护作用。方法将病毒感染的神经元加入不同浓度的HFRS病人恢复期血清(同时设立阴性血清对照组及正常细胞对照组和感染病毒对照组)，使用MTT比色试验检测神经元存活情况。结果各组神经元活性的MTT比色试验显示，病毒感染组与未感染对照组比较差异有非常显著性(P＜0.001)，阴性血清对照组与正常细胞对照组比较，差异也有统计学意义(P＜0.01)。HFRS病人恢复期血清保护组与阴性血清对照组各小组间比较差异也都有非常显著性(P＜0.001)。结论HFRS病人恢复期血清具有一定的中和病毒保护培养的神经元作用。

Protection effect of the convalescent serum from HFRS patient on the HTNV infected neurons in vitroWANG Hangyan*, ZHANG Menghua, WANG Yi, et al.*Department of Pediatrics, The General Hospital of PLA, Beijing 100853

【 Abstract 】ObjectiveConvalescent serum from patient of hemorrhagic fever with renal syndrome (CSPH) was added to the HTNV infected embryo mouse brain neurons to test the protective action of CSPH on HTNV.MethodsMorphological changes were observed with Phase-contrast microscopy and the viability of neuron cells were examined with MTT colorimetric assay.Results Significant difference of the A value formd between the HTNV infected neuron cell cultures and uninfected normal control cultures (P＜0.001). While no obvious differences were observed among different serum dose groups both in the convalescent serum protection group and in the negative serum control group (P＞0.05), significant differences of the A value were formed between the convalescent serum groups and the negative serum groups (P＜0.001).ConclusionsConvalescent serum from patient with HFRS may produce protective action to the mouse brain neuron culture cells infected with HTNV.

【 Subject words 】Hemorrhagic fever with renal syndromeHantaan virusCell,cultured Neurons

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome.HFRS)患者可出现神经系统症状，动物实验中乳鼠常常表现出严重的脑损伤^〔1〕。以往对HFRS脑损伤的报道仅限于神经细胞的变性坏死和炎症细胞浸润等。缺少有关HFRS恢复期病人血清对病毒感染的神经元保护作用方面的报道。本研究利用体外培养的小鼠胚胎脑皮质神经元感染汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)后，加入HFRS病人恢复期血清，观察其对HTNV感染神经元的保护性作用。

材料与方法

1.材料

(1) 仪器：CO₂孵箱(Nuaire日本)，超净台(国产)，IMT-2相差显微镜(Olympus日本)，解剖显微镜(国产)，ELISA-MR4000(Dynatech日本)，显微解剖器械(Sigma,美国)，96孔塑料培养板(Nunc,丹麦)。

(2)细胞培养用液：胎牛血清(Sigma,美国)，DMEM液(Gibco,美国)，马血清(Sigma,美国)，阿糖胞苷(Sigma,美国)，鼠尾胶元(使用大鼠鼠尾腱，自制)，D液(解剖用，自制)，0.125%胰酶(自配)。

(3)试剂：MTT(Sigma,美国)，DMSO(国产)，HTNV(本室保存)。

(4)实验动物：孕16～19天^〔2〕昆明种小鼠(第四军医大学实验动物中心提供)。

2.方法

(1)细胞培养：参照Ransom等^〔3〕细胞培养方法并加以改良。塑料培养板每孔以鼠尾胶元涂布后吹干；孕16～19天昆明种小鼠脱颈处死后，无菌条件下取出双侧子宫置冰盒上；解剖显微镜下剥离胎鼠大脑皮层，置D液中，仔细剥去血膜，吸去D液后，剪碎脑皮质，加入0.125%胰酶消化液消化30分钟(37℃)吸去消化液，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液；室温下终止消化10分钟；DMEM培养液洗一次，用吸管在含20%胎牛血清的DMEM培养液中将消化后的组织块吹打成细胞悬液；将细胞浓度调至10⁵/ml,每孔0.2ml接种于塑料培养板中，5%CO₂孵箱，37℃中培养。接种24～36小时后，每孔加入1μl阿糖胞苷(Ara-C)，终浓度为10μmol/L，抑制胶质细胞以及成纤维细胞等非神经元细胞过度增殖；作用24小时后，更换新鲜的完全培养液(含DMEM 90%，Hos 10%)，以后隔二日换液。

(2)HFRS病人恢复期血清及阴性对照组血清来源；临床确诊为HFRS病人的恢复期血清经IFA测定特异性IgG抗体滴度达1∶2560以上，使用稀释度为1∶20^〔4〕，血清置-20℃冻存。阴性对照组血清采自健康成人，血清HRFS特异性IgG抗体检查阴性，使用稀释度1∶20，血清置-20℃冻存。

(3)分组：随机将培养3天的神经元细胞分成A、B、C、D四组，每组各16孔，除D组外，每孔均加入HTNV(A9)上清液(1∶100)，每孔20μl。

A组：恢复期血清保护组：按加入恢复期血清量的不同，再分为20，30，40，50μl 4个小组。

B组：阴性血清对照组：按加入健康人血清量的不同，再分为20，30，40，50μl 4个小组。每孔用培养液补足至总容量为200μl，4小时后换新鲜培养液，继续培养2天。

C组：HTNV感染对照组：加入HTNV(A9)作用4小时后换新鲜培养液，继续培养2天。

D组：正常细胞对照组。

(4)呈色：用改良的Mosmann方法^〔5〕将培养5天的神经元，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃继续孵育4小时，终止培养，吸弃孔内培养液，每孔加入100μl dMSO,室温下静置10分钟。

(5)检测分析：将96孔板放在Dynatech MR 4000型ELISA读数仪上测各孔A570、A630的吸光度值，将A570值减去A630值，即为测定A值的结果。检测波长570nm,参考波长630nm。

(6) 统计分析：所得数据用方差分析进行检验。

结果

1.神经元一般形态：D组对照神经元种植24小时，镜下观察细胞已经贴壁，有团聚现象，部分神经元有小突起(图1)。加入阿糖胞苷作用24小时后，神经元背景清晰，细胞已伸出突起，成纤维细胞减少(图2)。培养5天的神经元间网络形成，易辨认区别。HTNV感染对照组(C组)经培养2日后，神经元部分漂浮，网络减少，且有中断现象，细胞胞体不清且较小。加入不同量(20μl至50μl)恢复期血清保护组(A组)中各小组的神经元外观形态均无大变化，神经元胞体清晰，神经元间网络形成。加入不同量(20μl至50μl)健康人血清对照组(B组)中各小组的神经元镜下观察细胞稀少，神经元胞体形态不一，神经元网络形成不良(图2，3，4)。

图1神经细胞接种24小时，绝大部分贴壁且有小突起 (×100)

Fig 1. After 24 hours neuron culture showing adherence of most neuron cells with synapse outgrowth (×100)

图2加入阿糖胞苷作用24～36小时，神经元间形成网络,胶质细胞停止增殖，背景清晰 (×100)

Fig 2. Network formation after 24～36 hours with addition of Ara-C.Among neurons appeared with cease of gliocytes growth (×100)

图3培养5天的正常神经元，细胞胞体及突起生长具佳 (×100)

Fig 3.Neuron culture after 5 days,showing better growth of neuron cells with synapse (×100)

图4HTNV感染后2天，神经元网络有中折现象，部分神经元折光差 (×100)

Fig 4. Two days after HTNV infection,showing disruption of neuron network and some less refractive neurons (×100)

2.MTT呈色反应结果：由表1结果可以看出，HTNV感染组与未感染的正常细胞对照组比较差异有显著性(P＜0.001)。HFRS病人恢复期血清保护组与阴性血清对照组差异有显著性(P＜0.001)，而A组中恢复期血清不同量各小组之间以及B组健康人血清不同量各小组之间比较，差异无显著性（P＜0.05)。

表1HFRS恢复期病人血清对HTNV感染小鼠神经元保护作用的MTT<