【 摘要 】目的分离新的B细胞活化基因。方法采用差异显示反转录PCR技术（DDRT-PCR）对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异显示情况进行分析，对显示片段进行克隆并行Northern分析，对Northern杂交阳性的cDNA片段进行测序并比较同源性。结果差异显示分析共获得明显差异表达的cDNA片段62条，选择主要表达于活化B细胞上的20条cDNA片段克隆到pGEM-T载体上，并逐一对静止和活化B细胞RNA进行Northern分析，其中6条cDNA片段在活化B细胞中呈Northern杂交阳性且与差异显示情况相符， 对它们进行测序，然后通过国际互联网与GenBank, EMBL和DDBJ的DNA数据库比较序列同源性，发现其中4个克隆与已发现的基因具明显同源性，一个克隆是新的， 另一个克隆虽然与人T细胞分泌的趋化因子I-309同源性达95%，但二者转录本不同。结论通过DDRT-PCR分离到两个可能为新的B细胞活化基因的cDNA片段，这为进一步克隆新的B细胞活化基因奠定了基础。

Differential display analysis of mRNA from human tonsil B lymphocytes and isolation of new EST from activated B lymphocytesYIN Jiyi, CUI Lianxian, ZHAO Qing, et al. National Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005

【 Abstract 】ObjectiveTo clone the novel B lymphocyte activation gene.MethodsThe differential display RT-PCR (DDRT-PCR) technique was applied to compare mRNA from human tonsil resting and activated B lymphocytes. The differential display cDNA fragments were recovered, reamplified and cloned into pGEM-T vectors, then Northern blots were carried out to analyse those fragments. The positive cDNA fragments were sequenced.ResultsSixty two differential display cDNA fragments were obtained. Twenty of the 62 cDNA fragments which were mainly or uniquely expressed on activated B lymphocytes were cloned into pGEM-T vectors, among which 6 clones were confirmed expressible on activated B cells by Northern blot analysis and named EST XB11, XD11, YA1, ZD11, ZD12 and ZE1 respectively. The sequence analysis had been finished. Four clones (XB11, YA1, ZD11 and ZD12) had high homology with recorded genes and one (XD11) was novel by a computer search against GenBank, EMBL and DDBJ DNA databases. The clone (ZE1) had 95% homology with human T cell-secreted chemokine I-309, but they had different transcript.ConclusionsTwo cDNA fragments (XD11, ZE1) are supposed to be potentially representive of novel B cell activation genes and this research lays a foundation for cloning novel B cell activation genes.

【 Subject words 】TonsilB lymphocytePolymerase chain reactionNorthern blot analysis

B淋巴细胞是机体重要的免疫活性细胞，它的主要功能是分泌免疫球蛋白，参与抗原提呈及免疫调节等。对活化B淋巴细胞功能基因的研究不仅可以了解B细胞的发生、活化、增殖、分化，而且可以对B细胞相关疾病的诊治提供理论指导。对一种特定的细胞而言，它的功能的发挥往往依赖于细胞表面或内部的一些蛋白的表达，而这些蛋白又是由细胞特异的基因编码。不同细胞的基因表达谱不尽相同，即使同一种细胞在其不同发育分化阶段所表达的基因谱也不相同,这为认识和分析生命过程的生物学本质提供了信息，也为分离特异的基因表达序列提供了可能。为了分析特异的mRNA序列，1992年Peng Liang等建立了差异显示反转录PCR技术(differential display RT-PCR,DDRT-PCR)^〔1〕，该方法为获得这类差异表达的特异基因提供了有效的手段。我们应用DDRT-PCR技术分离了6个差异表达在人扁挑体活化B淋巴细胞上的cDNA片段，本文对这些差异cDNA片段作了分析。

材料与方法

1.材料：人扁桃体取自北京儿童医院耳鼻喉科手术切除的样本。TRLzol试剂、MMLV反转录酶、Taq酶、AIM-V培养基、肉豆蔻佛波脂（PMA）、琼脂糖、尼龙膜均为美国GIBCO公司产品；无RNase 的DNase Ⅰ为德国BM公司产品；电泳设备为美国IBI公司产品; pGEM-T Easy Vector试剂盒及随机引物标记试剂盒(Prime-a-Gene Labeling System)为Promega公司产品，α-³²P-dCTP和α-³²P-dATP，北京亚辉生物工程公司产品；其它均为实验室常用分析纯级试剂或仪器。

2.人扁桃体B淋巴细胞的分离与活化：参照文献〔2〕进行，B细胞纯度经FACS鉴定为94%，细胞活化方法为细胞浓度10⁶/ml，每毫升含PMA 5ng，于AIM-V培养基中在37℃，5%CO₂条件下培养48小时，收集细胞，静止B细胞除不加PMA外，余同B细胞活化条件。

3.总RNA提取：按TRLzol试剂说明书提取静止和活化B淋巴细胞总RNA，用无RNase 的DNase I处理总RNA以消除残存的基因组DNA。

4.mRNA的差异显示：参照RNA Image^TM(GenHunter)说明操作，稍作改进，简而言之：分别取静止和活化B细胞总RNA 1.5μg，以oligo(dT)11M 〔T11M ,即oligo(dT)11A,T11A; oligo(dT)11G, T11G; oligo(dT)11C,T11C〕为引物进行反转录，然后以10个核苷酸的随机引物和反转录时相应的T11M引物，以第一链为模板进行PCR（94℃，30秒；40℃，2分钟；72℃，30秒。共40个循环）扩增，每个反应均做平行管。PCR产物行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，干胶后，压X光片，于-80℃曝光8～24小时。根据mRNA差异显示的情况，从凝胶中切取差异表达的凝胶条带，利用相应的引物重新做PCR。二次PCR产物经凝胶纯化后克隆到pGEM-T载体上。

5.Northern杂交：30μg的静止和活化B淋巴细胞总RNA行甲醛变性的1%琼脂糖凝胶电泳，转印到尼龙膜上，以从pGEM-T载体上酶切并回收的差异片段为探针，按随机引物标记试剂盒说明进行标记，同时，在探针标记时加入相应的T11M引物(2μm)1ul，杂交按文献〔3〕进行。

6.测序及序列比较：以ABI 373DNA自动序列分析仪测定DNA序列，测出的序列通过国际互联网(Internet)与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的非重复序列数据库进行序列同源性比较。

结果

1.人扁桃体B淋巴细胞mRNA的差异显示分析：应用3种oligo(dT)引物，5种随机的核苷酸引物，进行了15种不同引物组合的DDRT-PCR，对静止和活化B淋巴细胞的mRNA差异表达情况进行了分析。做PCR反应时，同一个样品同时做两个反应，并同时电泳，获得差异显示谱，切取可重复出现的条带，用同样的条件重做PCR，结果90%以上的条带经一轮40个循环的PCR后均获得成功，图1显示了静止和活化B细胞mRNA的差异表达情况。共获得差异表达的标签序列（Expressed Sequence Tag, EST) 62条， 其中静止B细胞差异显示带32条，活化B细胞差异显示带30条。

图1静止和活化B细胞mRNA的差异显示分析

Fig 1. Differential display analysis of resting and activated B cells mRNA

Total RNA were isolated from human tonsil resting and activated B cells, reverse transcribed, and followed by PCR in the presence of α-(³²P)dATP. The PCR products were displayed on 6% sequencing gel and autoradiogramed as detailed in “Materials and Methods”Lane 1 and 2： Resting B cells. Lane 3 and 4： Activated B cells. cDNA fragments XB11、XD11、YA1、ZD11、ZD12 and ZE1 are indicated by arrows

2.人扁桃体静止与活化B淋巴细胞mRNA的Northern杂交分析：从获得的62条差异显示带中，选择仅表达于活化B淋巴细胞或活化B细胞表达强的20条差异显示带克隆到pGEM-T载体上。经转化细菌、扩增、酶切，回收插入的差异显示片段，经同位素标记后作为探针，分别与静止和活化B淋巴细胞RNA行Northern杂交，结果其中6个探针为阳性与差异显示谱基本一致，图2为Northern杂交结果。将它们分别命名为EST XB11、XD11、YA1、ZD11、ZD12、ZE1。在差异显示的放射自显影X光片上，ZD11、ZD12两个克隆均为活化B细胞表达强而静止B细胞表达弱，而Northern杂交分析中，两个克隆均只在活化B细胞中出现非常浅的杂交带，在静止B细胞中无杂交信号，对XB11和XD11来说，二者均出现不同长度的转录本，可能系选择性剪切所致。

图2Northern杂交分析差异显示的cDNA片段

Fig 2. Northern hybridization analysis of differential displayed cDNA fragments

Lane 1. Activated B cell RNA， Lane 2. Resting B cell RNA

3.序列分析及同源性比较： 对6个经Northern证实的阳性克隆进<