【 摘要 】目的研究转染人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞抗补体的细胞毒作用。方法从人胎盘组织提取总RNA，用RT-PCR技术扩增得到人膜辅助因子蛋白（hMCP）基因全长cDNA，将其克隆到带有巨细胞病毒(CMV)IE启动子的pCI-neo哺乳动物表达载体和以pCI-neo为基础构建成的带有人EF-1α启动子的pEF-neo哺乳动物表达载体上，得到质粒pCIM和pEFM。利用电穿孔基因转移方法分别转染猪内皮细胞(PEC)，以G418筛选稳定表达克隆。用正常人血清处理此转基因细胞来检测其抗补体作用。结果Northern杂交结果表明，在EF-1α启动子引导下的hMCP基因得到了高效表达。死细胞计数和LDH释放实验结果表明，表达hMCP基因的PEC可有效抑制人血清补体对其的裂解作用（P＜0.01)。结论克隆的hMCP基因在EF-1α启动子引导下于PEC可高效表达，且使PEC能够抗人补体的细胞毒作用。

Inhibition of the cytotoxicity of human complement by porcine endothelial cells expressing human membrane cofactor proteinBAI Cheng，QIAO Dianhua，SUN Fangzhen. Open Laboratory of Institute of Developmental Biology, Beijing 100080

【 Abstract 】ObjectiveTo study the resistance of porcine endothelial cells transfected by human membrane cofactor protein gene to cytotoxicity of human complement.MethodsThe cDNA encoding human membrane cofactor protein(hMCP) was cloned from human placenta total RNA by RT-PCR . It was inserted into pCI-neo mammalian expression vector and pEF-neo vector which was derived from pCI-neo vector. Expression plasmids pCIM and pEFM were got. Porcine endothelial cells(PEC) grew to log phase and transfection was performed by electroporation. The stable expression clones were selected with G418. The resistance of transgenic PEC to human complement was tested by treating the cells with normal human serum.ResultsNorthern blot indicated that hMCP gene driven by human EF-1α promoter got expressed efficiently. Dead cell count and LDH release results indicated that the PEC which expressed hMCP gene could effectively inhibit the cytotoxicity of human complement.ConclusionshMCP gene driven by EF-1α promoter in PEC can express effeciently and the transfected PEC can inhibit the cytotoxicity of human complement.

【 Subject words 】Human membrane cofactor proteinEndothelial cellStable expression

目前，可供人类移植用的同种器官日益缺乏，人们希望异种动物的器官能够用于人类器官移植。猪器官在解剖和生理方面与人相近，且猪易于饲养繁殖，故被选为可向人类提供器官的动物。但猪血管器官中血管内皮细胞表面具有异种抗原Galα1-3Gal^〔1〕，可被人血中的异种天然抗体(XNA)所识别^〔2〕，通过经典途径激活人的补体^〔3〕；而猪内皮细胞(PEC)膜上的补体调控蛋白(CRP)因其种的特异性不能抑制人补体对其攻击作用^〔4〕，使得XNA和补体损伤或激活PEC，最终导致移植器官的炎症和血栓形成，使猪器官在十几分钟到几小时之内被排斥掉，即所谓超急性排斥(HAR)^〔5〕。将人的CRP, 如膜辅助因子蛋白(membrane cofactor protein, MCP)基因转到猪体内将有可能抑制或减弱人补体对猪器官的攻击作用。

MCP是一种存在于血细胞、内皮细胞等细胞膜上的糖蛋白，其相对分子质量为45(70)×10³，它辅助血清中的I因子裂解C3b和C4b，抑制C3和C5转化酶的形成；这种对补体激活的早期抑制作用可有效地阻止后续级联反应的发生，使靶细胞免遭补体的攻击。我们利用已知的hMCP序列，自行设计引物，从人胎盘组织克隆到了hMCP基因，构建了哺乳动物表达载体，并在猪内皮细胞中得到了高效表达并可有效抑制人补体的攻击作用。

材料与方法

1. 材料、试剂和酶：新鲜人胎盘，离体6小时以内，由北京海淀医院妇产科提供。正常人血清（NHS）购自北京红十字会血库。分子克隆所用的酶，EcoRⅠlinker，质粒DNA提取试剂盒，逆转录试剂盒及随机引物标记试剂盒为Promega产品，Taq plus Ⅱ DNA聚合酶(含5% Deep vent DNA聚合酶)为上海Songer产品。T7 DNA测序试剂盒为Pharmacia产品，(α-³²P)dCTP为Dupont产品，胎牛血清为天津生化制品所产品，抗von Willebrand因子(vWF)单抗和FITC标记的二抗为DAKO产品，其它试剂均为AR或以上级。

2. 质粒、菌株：pBluescript II SK^+/－ Phagemid为Stratagene产品，pCI-neo为Promega产品。E.coli DH5α为质粒转化的受体菌株。

3. 组织总RNA提取和RT-PCR：取新鲜人胎盘组织，在液氮中研磨后，用异硫氰酸胍一步法提取总RNA^〔6〕。RT-PCR合成和扩增hMCP基因：(1)逆转录反应按试剂盒说明书操作。(2)PCR反应：设计的上下游引物分别为5'ATTGTTGCGTCCCATATC 3'和5'ATTCAAGCCACATTGCAA 3'。取逆转录反应混合物2μl作模板进行hMCP cDNA的扩增反应，条件为94℃ 45秒，54℃ 1分钟，72℃ 2分钟，共进行30个循环。

4. hMCP cDNA克隆及表达载体构建：电泳回收PCR产物，用T4 DNA聚合酶补平产物末端，加EcoRⅠ linker，将片段插入到pBluescript的EcoRⅠ位点，转化DH5α菌，筛选重组克隆并进行酶切鉴定。表达载体构建见图1。

图1pCIM和pEFM哺乳动物表达质粒构建示意图

Fig 1. Construction of pCIM and pEFM mammalian expression plasmids

5. 序列分析：用Sanger双脱氧核苷酸末端终止法，参照T7 DNA测序试剂盒说明进行。为保证序列分析的准确性，分别选3个克隆进行测定。为测全长cDNA序列，利用基因内部BamH Ⅰ和Sca Ⅰ位点将其切为5'端418bp、中间511bp和3'端551bp 3个片段，做成3个亚克隆进行正反方向测序，见图2。

图2hMCP基因测序策略示意图

Fig 2. Sequencing strategy of hMCP gene

6. 细胞培养和DNA转染：猪内皮细胞的原代培养参考Ryan等^〔7〕的方法，以含20%FCS、4mmol/L Glutamine、20mmol/L Hepes、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199于37℃,5% CO₂ 培养箱中培养，传代时以trypsin/EDTA消化，1∶3传代。内皮细胞(EC)鉴定：镜下呈鹅卵石状；用抗vWF单抗和FITC标记的二抗做免疫组化鉴定，荧光显微镜下显示核周呈强荧光。实验用细胞为5～10代(细胞长满培养板后，以trypsin/EDTA消化，1∶3传代，2～3天后细胞长满，再传代)。DNA转染：收集对数生长期细胞10⁷，PBS洗去培养液，以0.4ml PBS悬浮细胞置电转杯中，电击条件为：600V、60μs、3次。电击后仍以M199培养，24小时后加G418，以500μg/ml的浓度筛选稳定表达克隆。

7. 死细胞计数（DCC）和LDH释放实验：各组细胞计数后等量接种于方格培养皿内，细胞长至(50～60)%成片时，换入含20% NHS的M199培养液，2小时后随机计数9个方格内的受补体攻击至死的PEC，取平均值。

DCC%=死细胞数/接种时细胞数×100%。

LDH释放实验参照Korzeniewski等^〔8〕的方法，细胞接种于24孔板内，每孔10⁵,每组3复孔。长满后换入含20%NHS的PBS，自发释放为PBS处理，最大释放为Triton X-100处理，2小时后取各孔上清100μl于酶标板内，加100μl底物反应液(54mmol/L Lactate、0.66mmol/L INT、0.28mmol/L PMS、1.3mmol/L NAD 于0.2mol/L Tris CI中，pH 8.2）于37℃温育20分钟，酶标仪读取490nm的吸光度值，结果为5次实验的平均值。

细胞毒%=(实验组LDH释放-自发LDH释放)/(最大LDH释放-自发LDH释放)×100%。

结果与讨论

1. 带有hMCP基因的表达载体酶切鉴定：将hMCP基因片段分别装到有CMVIE和EF-1α启动子的哺乳动物表达载体pCI-neo和pEF-neo的EcoRⅠ位点，对获得的重组质粒pCIM和pEFM进行限制酶切分析表明，hMCP基因片段在两种表达载体的EcoRⅠ位点均为正向插入，克隆到的核苷酸序列总长为1480bp，包括5'端上游104bp序列，中间1131bp编码序列和3'端245bp非编码序列。从第105到1235位核苷酸编码377个氨基酸，相对分子质量约为45×10³，与Purcell等^〔9〕报道的去糖基化的MCP相对分子质量和Ballard等^〔10〕报道的MCP前体相对分子质量相近。由文献报道可知^〔11〕，N端34个氨基酸为信号肽序列，在成熟蛋白的1位到251位氨基酸含有4个短同源重复序列(SCR)，每个长约63个氨基酸，其功能还不清楚。从253位到280位的28个氨基酸序列富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸，有许多N连接和O连接的糖基化位点，成熟蛋白相对分子质量的增加与这些部<