【 摘要 】目的研究自杀基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤B16F10细胞3天后，分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠GM-CSF的重组腺病毒AdGM-CSF和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的腺病毒AdCD，然后连续10天腹腔注射5氟胞嘧啶（5FC）（AdCD/5FC/AdGMCSF组）、单用AdCD/5FC组、单用AdGM-CSF组、注射对照病毒AdlacZ/5FC组或PBS组。结果与接受AdCD/5FC、AdGM-CSF、AdlacZ/5FC或PBS治疗的荷瘤小鼠比较，经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制，荷瘤小鼠的存活期明显延长（P＜0.01）。经AdCD/5FC/AdGMCSF联合基因治疗后，肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、CD8⁺T细胞浸润，黑色素瘤细胞表达MHC-Ⅰ和B7-1分子明显增加，荷瘤小鼠脾细胞对B16F10黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论联合应用自杀基因和GM-CSF基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞，又可提高机体对肿瘤的免疫应答，两者可协同发挥抗肿瘤作用。

Therapeutic effect of combined treatment with CD suicide gene and GM-CSF gene on murine melanoma and its immunological mechanismJU Dianwen, CAO Xuetao, WANG Baomei, et al. Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433

【 Abstract 】ObjectiveTo observe the therapeutic effect of adenovirus expressing cytosine deaminase (AdCD) in combination with adenovirus expressing GM-CSF (AdGMCSF) followed by administration of a kind of prodrug, 5 fluorocytosine (5FC) on melanoma in mice.MethodsMelanoma-bearing mice were administered with AdCD/5FC/AdGMCSF, AdCD/5FC, AdGM-CSF, control adenovirus AdlacZ/5FC, or PBS.ResultsThe results demonstrated that significant growth inhibition of established tumors and prolongation of survival period were observed in tumor-bearing mice after AdCD/5FC/AdGMCSF combined therapy when compared with mice treated with AdCD/5FC, AdGM-CSF, AdlacZ/5FC, or PBS (P＜0.01). The activity of cytotoxic T lymphocytes could be induced significantly after the combined therapy. The expression of MHC-I and B7-1 molecules on freshly isolated tumor cells after combined therapy increased greatly, and more dendritic cells and CD8⁺ T cells infiltrated into the tumor mass when measured with FACS.ConclusionOur results suggest that combined therapy with suicide gene and GM-CSF gene transfer could directly eradicate established tumors and efficiently induce the antitumor immunity of the mice.

【 Subject words 】Gene therapyAdenovirusSuicide gene GM-CSFNeoplasms/therapy

大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase, CD)是一种哺乳类细胞上不存在，但可将无细胞毒性的抗真菌药物5氟胞嘧啶（5FC）转化为细胞毒药物5FU的酶，将此酶的基因转染肿瘤细胞后用5FC治疗，可大量杀伤肿瘤细胞^〔1〕。CD自杀基因转移的治疗试验表明，该疗法可以明显消除肿瘤负荷，用于各种实验性肿瘤的治疗，但是该疗法所显示的机体抗肿瘤免疫能力较弱，肿瘤容易复发^〔2，3〕。近年来，许多细胞因子的基因治疗项目已经进入临床并取得了一定的疗效^〔4〕。细胞因子基因，如GM-CSF基因转移至肿瘤细胞内可以大大增强肿瘤细胞的免疫原性，提高诱导机体特异性的抗肿瘤免疫反应，但是该作用不够强大，对已发生的肿瘤治疗效果较差。本研究将CD自杀基因与小鼠GM-CSF基因联合转移，然后给予5FC治疗，发现两者可发挥协同抗肿瘤作用，其作用机理与增强机体的特异性抗肿瘤免疫功能有关。

材料与方法

1.动物及细胞株:C57BL/6小鼠,雌雄不拘,6～8周龄,购自上海SIPPR-BK试验动物有限公司。B16F10黑色素瘤细胞株和NK敏感的YAC-1细胞株由本室常规传代培养。

2.试剂: 大鼠抗小鼠树突状细胞单抗NLDC145、大鼠抗小鼠CD8单抗购自Pharmingen，FITC标记的兔抗大鼠二抗，PE标记的大鼠抗小鼠MHC-I（H-2D^b）、B7-1单抗购自美国Boheringer公司，5-氟胞嘧啶(5FC)购自美国Sigma公司，Na⁵¹CrO₄购自英国Amersham公司。

3.腺病毒载体的构建与扩增:重组腺病毒AdGM-CSF、AdCD和AdlacZ由日本东京癌症研究中心Hamada博士构建并惠赠。重组腺病毒感染293细胞进行扩增并用此细胞测定病毒滴度(PFU)，用PBS配成10⁹PFU/ml备用^〔5〕。

4.试验分组及其治疗: C57BL/6小鼠皮下注射10⁵B16F10细胞，3天后随机分为5组，每组15只，在荷瘤部位分别皮下给予PBS、AdlacZ、 AdCD、AdGM-CSF、或AdCD/AdGMCSF。腺病毒注射量为每只小鼠10⁸/0.1ml，1周后重复同样的注射1次。第一次注射腺病毒后第二天开始，AdlacZ,AdCD以及AdCD/AdGMCSF注射组腹腔注射5-氟胞嘧啶（5FC）300mg/kg，每天1次，连续10天。治疗结束后，每组杀死5只小鼠进行免疫功能检测、肿瘤细胞表面分子分析。荷瘤后隔天测量肿瘤结节长和宽各1次，瘤体体积表示为(0.5×长×宽²)mm³。

5. 细胞杀伤活性检测:荷瘤小鼠经不同治疗后，制备脾细胞悬液，脾细胞直接作为NK效应细胞，野生型B16F10细胞经⁶⁰Co照射后与荷瘤小鼠脾淋巴细胞以1∶20的比例置于含20%FCS、20U/ml重组IL-2的RPMI 1640培养基中，于37℃，5% CO₂ 孵箱中孵育6天后，检测CTL杀伤活性。以YAC-1和B16F10作为NK和CTL杀伤的靶细胞，按常规4小时Na⁵¹CrO₄释放法检测脾细胞NK活性和CTL活性^〔6〕。杀伤百分率计算为：

6.细胞的FACS分析: 荷瘤小鼠治疗结束后取瘤体，剪碎并过不锈钢筛网以制备单细胞悬液，然后将单细胞悬液用Ficoll-Hypaque(1.088)不连续梯度密度分离液进行分离（3000 r/min×20分钟），得到肿瘤细胞和浸润的单个核细胞，肿瘤细胞和浸润的单个核细胞的纯度经过染色分析均达到95％以上。调整单个核细胞细胞浓度至10⁵/ml，加入大鼠抗小鼠树突状细胞特异性标志NLDC145单抗或CD8单抗，4℃放置30分钟,PBS洗两遍，加入FITC标记的兔抗大鼠二抗，4℃放置30分钟,PBS洗两遍，然后将细胞悬浮于0.2ml PBS中，进行流式细胞分析，试验同时设置抗体阴性对照，以确定瘤体中树突状细胞和CD8⁺T细胞的浸润情况。瘤细胞悬液直接加入PE标记的MHC-I（H-2D^b）、B7-1单抗进行孵育，然后在BD公司FACStar流式细胞仪上检测肿瘤细胞表达MHC-I和B7-1水平。

7. 统计学处理: 用未配对t检验。

结果

1.对荷瘤小鼠皮下肿瘤生长的抑制作用:如图1所示，经AdGM-CSF或AdCD/5FC治疗后与AdlacZ/5FC或PBS组比较肿瘤生长均显示出一定的抑制作用(P＜0.05)；经AdCD/5FC/AdGMCSF联合治疗后小鼠的皮下肿瘤生长与其它4组小鼠比较肿瘤生长的抑制作用更加明显（P＜0.01），部分小鼠的肿瘤完全消失。

图1AdCD/5FC和/或AdGMCSF治疗后黑色素瘤皮下生长曲线(n=10)

Fig 1.Growth curve of subcutaneous melanoma in tumor-bearing mice after AdCD/5FC and/or AdGMCSF administration

2. 联合治疗后荷瘤小鼠的存活期:存活期观察结果表明，经PBS或AdlacZ/5FC治疗的小鼠在40天内全部死亡，而经单用AdGM-CSF或AdCD/5FC治疗后小鼠存活期明显延长，其中经AdCD/5FC治疗后荷瘤小鼠有2只长期存活、经AdGM-CSF治疗的小鼠有1只长期存活；经AdCD/5FC/AdGMCSF联合治疗后荷瘤小鼠存活期延长更加明显（P＜0.01），5/10的荷瘤小鼠瘤体消失，小鼠可长期存活（图2）。

图2AdCD/5FC和/或AdGMCSF治疗后荷瘤小鼠的存活期(n=10)

Fig 2.Survival period of melanoma-bearing mice treated with AdCD/5FC and/or AdGMCSF

3.经AdCD/5FC/AdGMCSF联合治疗后荷瘤小鼠的NK、CTL活性变化: 图3A的试验结果表明，荷瘤小鼠经AdCD/5FC和/或AdGMCSF治疗后小鼠脾细胞的NK活性与对照组PBS、AdCD/5FC比较没有变化； 荷瘤小鼠经AdlacZ/5FC或AdCD/5FC治疗后小鼠脾细胞CTL活性与PBS组比较有所升高(P＞0.05），荷瘤小鼠经AdGM-CSF治疗后CTL活性明显高于PBS、AdlacZ/5FC或AdCD/5FC治疗组（P＜0.05），经AdGM-CSF联合AdCD/5FC治疗后小鼠脾细胞CTL活性升高更加明显，明显高于其它四组（P＜0.01，图3B）。