【 摘要 】目的探索利用特异多克隆抗体结合噬菌体递呈(phage display)随机肽库，进行病原体蛋白质的B细胞抗原表位研究。方法采取特异抗原→特异多克隆抗体→相应抗原表位的技术路线。所选研究对象为丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白。实验分三步：(1)抗HCV核心蛋白多克隆抗体的制备。用活化的Sepharose 4B耦联重组的HCV核心蛋白，亲和层析纯化丙型肝炎病人血清中特异的抗核心蛋白多克隆抗体。(2)随机肽库的生物淘洗(biopanning)。以纯化的多克隆抗体作为筛选分子，生物淘洗噬菌体递呈的随机七肽库。(3)阳性噬菌体克隆的鉴定。将筛选的噬菌体克隆进行ELISA检测、DNA测序以及竞争抑制试验等，最后分析所获资料。结果七肽氨基酸序列分析表明，HCV核心蛋白存在着至少3个B细胞抗原位点，其中19～25aa间(PQDVKFP)的线性表位是该蛋白的优势表位，证实了本研究策略的可行性。结论本技术路线可以有效地进行HCV核心蛋白的B细胞抗原表位研究。由此推论，此方法也可移植于其它病原微生物抗原或自身抗原的表位研究，继而为基于抗原表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据。

Epitope mapping of polyclonal antibodies to HCV core protein using a phage peptide libraryDU Yong, WANG Haitao. Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071

【 Abstract 】ObjectiveTo design and testify a novel strategy for epitope mapping by using disease-specific polyclonal antibodies and phage peptide library.MethodsThe core protein of hepatitis C virus(HCV) was chosen as target protein. The strategy included three steps: (1) Preparation of specific anti-core polyclonal antibodies. The recombinant core protein of HCV was linked with CNBr-Sepharose 4B. The anti-core polyclonal antibodies in HCV-positive sera were purified by affinity chromatography. (2) Biopanning of a phage peptide library. By using the specific polyclonal antibodies as selective moleculars, a 7 meres phage peptide library was biopanned, and the positive clones were selected. (3) Identification of the epitopes: the positive clones were confirmed by ELISA , competition assay and DNA sequencing. Amino acid sequences of positive clones were compared with the aa sequence of HCV core protein.Results31 positive clones were chosen and DNA sequenced. By experiments and sequence comparison, three epitopes were conformed in the N-terminal(1-125aa) of HCV core protein, and the linear epitope at residues 19-25 was the dominant epitope. These results agreed to other reports using overlapping peptides to make epitope mapping.ConclusionsThe designed strategy starting with target protein can be effectively used for epitope mapping, thus providing a new approach for some other pathogens specific epitope discovery and provide the potential for developing diagnostic reagents or vaccine.

【 Subject words 】Hepatitis C virusEpitope mappingPhage peptide libraryPolyclonal antibodiesHCV core protein

病原体的蛋白质抗原表位分析既是研究抗原分子的结构和功能、抗原-抗体反应机制的基础，又可为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要的线索和依据。分析抗原表位的传统方法主要是利用抗血清筛选重叠(overlapping)合成肽，但此方法存在几方面的缺陷^〔1，2〕，首先是合成肽的成本高；其次是该方法的应用必须先确定蛋白质的氨基酸序列，才能合成相应的肽，而在实际研究中，许多蛋白质的序列并不清楚，故限制了此方法的应用；更主要的是，完整蛋白产生的抗血清中，抗构象型表位的抗体占90%，只有10%属线性表位抗体，而线性的合成肽仅能模拟蛋白质的线性表位，无疑会丢失众多的构象型表位信息。

近年来，一种新的生物技术——噬菌体递呈随机肽库(random peptide libraries，RPL)被逐渐用于蛋白质抗原表位分析。这种技术弥补了合成肽筛选的不足^〔3，4〕，在研究线性短肽、折叠的蛋白质，甚至非蛋白分子等受体的相应配体时，噬菌体递呈的随机肽库被认为是配体的“万能库”。这些配体不一定和天然的配体完全相同，但是能模拟天然配体的结合特性(mimotope)。基于此理论，在抗原-抗体的识别研究中，不必源于天然抗原，就可从随机肽库中直接筛选出能和抗体结合的表位，这些表位既可以是线性表位，也可以是模拟的构象型表位。而且，此种方法不必预先确定蛋白质的氨基酸序列。

本研究中，我们设计了利用噬菌体递呈随机肽库结合特异多克隆抗体研究蛋白质B细胞抗原表位的技术路线：首先用具有抗原活性的HCV核心蛋白耦联Sepharose 4B，亲和层析纯化丙型肝炎病人血清中特异的抗HCV核心蛋白多克隆抗体。再以此多克隆抗体作为受体分子，筛选噬菌体递呈的随机七肽库，进行了HCV核心蛋白B细胞抗原表位的研究。

材料与方法

1.随机肽库：噬菌体递呈随机肽库(Ph.D.^TMphage peptide library)购自美国NEW ENGLAND Biolabs公司。肽库的滴度为2×10¹³PFU/ml，随机多样性为2×10⁹。受体菌为E.coli ER2537。测序引物(-28 gⅢsequencing primer):5'-GTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3'。

2.试验用血清：采自河北省固安县的4名慢性HCV携带者，每人静脉取血200ml，分离血清，-20℃冻存。经ELISA鉴定，抗HCV抗体均阳性。

3.主要试剂：CNBr-Sepharose 4B购自Pharmacia公司。HCV核心蛋白(P19)由本实验室在大肠杆菌中表达、纯化。HRP标记兔抗M13噬菌体IgG抗体、HRP标记羊抗人IgG抗体由本所制备、标记。合成肽CP9(5～46aa)由本室唐时幸博士赠送。

4.亲和层析纯化特异抗体：首先以50%，33%的饱和硫酸铵分步沉淀400ml丙型肝炎病人血清中的IgG抗体。将提取的IgG溶液混悬已耦联HCV核心蛋白P19的Sepharose 4B，室温下充分亲和吸附。将样品装柱，PBS洗去未结合的蛋白。用0.2mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.2)洗脱结合的特异蛋白。SDS-PAGE分析洗脱液，并按以下公式计算蛋白浓度：

蛋白浓度(mg/ml)=A280×1.55-A260×0.74

5.肽库的生物淘洗(biopanning):将抗HCV核心蛋白多克隆抗体稀释至150μg/ml,每孔150μl包被微孔，3%BSA封闭。用300μl TBST缓冲液稀释10μl肽库原液，按100μl/孔加到微孔内，室温缓慢摇荡1小时。TBST缓冲液洗涤10次。每孔加入100μl 0.2mol/L甘氨酸-盐酸(pH2.2)，室温10分钟洗脱结合的噬菌体。加入20μl 2mol/L Tris中和洗脱液。测定洗脱液噬菌体滴度。余下的洗脱液加到20ml E.coli ER2537培养液中(A600=0.5～1.0)。37℃250r/min培养5小时。制备繁殖后的噬菌体，并测定滴度。计算噬菌体产量：%产率=(洗脱噬菌体数÷淘洗用噬菌体数)×100%。按上述步骤再淘洗2次。第三次淘洗的噬菌体感染E.coli ER2537后，铺制平板。挑取单个噬斑，制备原种。经ELISA鉴定阳性克隆。对阳性克隆提取单链DNA，测序。

6.噬菌体的ELISA检测：抗HCV核心蛋白多克隆抗体包被酶联板。3%BSA封闭后，加入稀释液和噬菌体原种各50μl,37℃孵育1小时，洗涤缓冲液洗板3次。加入1∶1000稀释的酶标兔抗M13噬菌体抗体，37℃反应1小时。OPD显色，测定吸光度A490值。

7.竞争试验：将制备的噬菌体稀释至10¹¹/ml，包被酶联板。3%BSA封闭。将合成肽CP9(20μg/ml)先与¹²⁵I标记的抗HCV核心抗体在37℃孵育1小时，再加到封闭后的酶联板孔中，37℃作用1小时，洗涤，测定cpm。计算抑制率：

抑制率=(抑制前cpm-抑制后cpm)/抑制前cpm×100%

8.序列测定：采取Sanger双脱氧链终止法测序。提取噬菌体单链DNA，测序程序按试剂盒说明书操作。

结果

1.抗HCV核心蛋白多克隆抗体的制备与特异性检测：本试验所用的HCV重组核心蛋白为在大肠杆菌中表达，经Ni-NTA层析纯化、自然复性，纯度达到电泳级，ELISA检测可以和丙型肝炎病人血清发生特异反应。

经定量测定，用上述HCV核心蛋白从400ml HCV感染者血清中亲和层析纯化了1.86mg抗HCV核心蛋白抗体。与血清中抗体滴度相比，此特异多克隆抗体大约浓缩了3200倍。

ELISA方法比较制备的HCV核心抗体、艾滋病人IgG抗体、静脉用混合人IgG抗体与P19蛋白的免疫反应。从图1可以看出，纯化的抗体和P19的反应呈高度特异性，稀释至7.4ng/ml仍有很强的反应，而对照用的两种抗体和P19基本无反应。

图1三种抗体与P19蛋白的ELISA反应

Fig 1. Immunoreaction of P19 with three kinds of antibodies by ELISA

<