设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
HBV DNA vaccine immunization the effects of DNA vector constructs and routes of gene delivery on the induction of antiviral immunityYUAN Zhenghong, FANG Xin, ZHENG Lingjie, et al. Department of Molecular Virology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【 Abstract 】ObjectiveTo investigate the effects of DNA vector structure and different routes of administration on the efficiency of induction of immune responses to the HBV surface antigen (HBsAg) in mice by DNA immunization.MethodsDNA vectors that contained or did not contain amplicilin resistance gene (pcDNAI/Amp, pcDNA1.1) were engineered to contain HBsAg encoding gene fragments. The efficiencies of these vector constructs to prime antibody responses were compared in mice by detection of serum HBsAg-specific antibody titers after intramuscular immunization. The effects of CpG motifs and routes of administration (intramuscular, intradermal and skin abrasion) on the immunogenicity of DNA vaccines were also studied.ResultsRecombinant vector pcDNAI/Amp/SA that contained ampicilin selection gene stimulated significantly higher levels of HBsAg-specific serum antibody after intramuscular DNA injection than the pcDNA1.1/SA vector which did not contain antibiotics resistance gene. The immunogenicity of pcDNA1.1/SA was increased by coadministrating CpG-containing oligos while that of pcDNAI/Amp/SA was reduced. Both intradermal gene administration and intramuscular injection could induce strong antibody responses, while skin abrasion could not.Conclusion1.Different vector constructs induced different levels of immune responses; 2. CpG motifs present in ampicilin resistance gene play an important role in the immunogenicity of DNA vaccines; 3. Compared with intramuscular injection, intradermal adminstration was an simple and efficient way for application of DNA vaccines.
【 Subject words 】Hepatitis B virusDNA vaccineVector constructGene deliveryImmune response
DNA疫苗是近年来免疫学和疫苗研究领域中的一个热点。由于它能克服传统疫苗的缺陷，制备简单，同时诱发持久的特异性细胞及体液免疫应答，并可兼作预防和治疗性疫苗，是未来新型疫苗的发展方向，在病毒性疾病和肿瘤等的防治中有广阔的应用前景〔1〕。Davis和Whalen等〔2〕把这一新技术应用于乙型肝炎病毒的研究，他们把含乙肝病毒表面抗原(HBsAg)编码基因的表达质粒通过肌内注射免疫小鼠，成功地诱发了针对HBsAg的细胞和体液免疫。Mancini等〔3〕在有HBV复制的转基因小鼠中发现，肌注HBV DNA疫苗可逆转小鼠对HBV的免疫耐受，诱导产生抗HBsAg的抗体，清除血液中游离病毒，并抑制肝内HBV的复制。这提示DNA疫苗有可能成为防治乙肝的一条新途径。
然而，要使DNA疫苗从动物实验转为临床使用，尚有许多工作要做。这是因为：1)对DNA疫苗的免疫机制还远未了解；2)DNA疫苗的效率有待加强，接种途径需进一步简化；3)DNA疫苗的安全性(主要涉及载体结构)尚待进一步确认。
为深入探讨应用DNA疫苗防治乙肝病毒感染的可能性，构建具有高度免疫原性，安全的可在人体内使用的DNA疫苗用载体，简化DNA疫苗接种途径，本研究比较了不同HBsAg表达载体pcDNA1.1/SA(无抗性基因)、pcDNAI/Amp/SA(含氨苄青霉素抗性基因)的免疫效果及不同接种途径(肌内、皮内、皮肤划痕)对DNA疫苗诱生免疫效果的影响。同时，研究了CpG免疫刺激元件对DNA疫苗的作用。初步研究结果表明，不同HBsAg表达载体诱生免疫应答的能力不尽相同；CpG免疫刺激元件在决定DNA疫苗免疫原性中起重要作用，可增强不含相应结构DNA疫苗的免疫效果；皮内注射可诱发与肌内接种相似的免疫应答，是一种简便、有效的免疫接种途径。
材料与方法
1.质粒、菌株及试剂：质粒pcDNA1.1、pcDNAI/Amp购自Invitrogen公司。菌株DH5α来自Gibco BRL公司，用于pcDNAI/Amp质粒的构建及扩增；菌株MC1061/P3购自Invitrogen公司，用于pcDNA1.1质粒的构建及扩增(MC1061/P3具有卡那霉素抗性，但对四环素和氨苄青霉素敏感；经pcDNA1.1转化后MC1061/P3转对四环素和氨苄青霉素抗性，以此进行筛选)。
各种工具酶及试剂分别购自Boehringer Mannhein、Promega、Qiagen、Gibco BRL、华美和华顺生物试剂公司。检测HBsAg和鼠抗HBsAg抗体试剂盒由上海市传染病医院肝炎免疫室提供。
2.DNA重组及质粒大量制备：以pADR〔4〕(含我国adr型HBV基因，由中科院上海生化所提供)为模板，PCR扩增获得目的基因(含HBsAg编码基因及HBV polyA信号，1.8kb;引物序列为：正引物5'-ATGAATTCATGGAGAACATCACA-3'，反引物5'-ATGAATTCAAGAAGTCAGAAGGC-3')。HBsAg真核细胞表达载体的构建按文献〔5〕进行。DNA免疫用质粒均采用Qiagen Plasmid Maxi Kit制备及纯化，溶于生理盐水。
3.含免疫刺激元件寡核苷酸(ISS)的设计及合成：ISS按CpG两侧分别有两嘌呤及两嘧啶相邻设计，序列为5'CCGAACGTTCGGGC3'；同时设计一无关序列为对照：5'GAAGTTTCCTGTGTGTACCC3'。寡核苷酸由中科院生物工程中心合成。
4.HBsAg重组载体在细胞内的表达情况：按本室常规采用磷酸钙沉淀法将HBsAg重组转染人肝癌细胞HepG2。HepG2细胞在转染前24小时以106/皿接种于55mm培养皿，转染4小时前换液。每平皿内加入由10μg质粒DNA、500μl 1×HeBS、31μl 2mol/L CaCl2组成的混合物。每种重组载体转染两平皿，并用空载体为对照。实验中同时采用SEAP(分泌性碱性磷酸酶)报告基因pBC12/CMV/SEAP共转染HepG2细胞，以作为转染效率的内参〔7〕。
5.实验动物和动物免疫：BALB/c小鼠购自上海医科大学实验动物部，为6～8周龄雌性小鼠。小鼠用戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉后，分三种途径免疫。A.肌内注射：用1ml注射器于双侧胫前肌处进针，缓慢注入质粒DNA溶液(每侧50μl/20μg)；B.皮内注射：在离鼠尾根部5～10mm处，注入质粒DNA溶液(40μg/50μl)；C.皮上划痕：在小鼠背部皮肤造成创伤后，涂布40μg质粒DNA。每实验组注射4只小鼠。
6.鼠抗HBsAg抗体(HBsAb)检测：免疫后定期从尾部采血,分离血清，-20℃保存。一并用ELISA法检测鼠抗HBsAg抗体。每小鼠血清分双孔测定，操作按说明书进行，492nm检测吸光度(A)值。实验测定值取组内小鼠(4只/组)测定值的均值。
7.统计处理：采用两样本均数比较的t检验。
结果
1.插入我国adr型HBV S基因的真核细胞表达质粒载体的构建：通过PCR、酶切、基因重组等技术分别构建了插入我国adr型HBV表面抗原编码基因加HBV polyA信号的重组载体pcDNA1.1/SA、pcDNAI/Amp/SA，测序确认插入方向和编码框架。两表达载体的结构仅在抗性基因上存在差异(图1)，pcDNA1.1/SA无抗性基因，pcDNAI/Amp/SA含氨苄青霉素抗性基因。
图1乙肝病毒表面抗原真核细胞表达载体结构示意图
Fig 1. Construction of HBsAg expression vectors
2.HBsAg重组载体在HepG2细胞内的表达情况：质粒DNA转染HepG2细胞72小时后收集培养上清，ELISA测定培养上清中HBsAg的表达，取平行两皿测定值的均值。同时用SEAP测定值调整各平皿的转染效率以使HBsAg测定值具有可比性。结果发现，重组载体pcDNA1.1/SA、pcDNAI/Amp/SA均可在HepG2细胞中表达HBsAg，两者的表达水平相近(图2)〔培养上清1∶10稀释后的HBsAg测定值(A)分别为：pcDNA1.1/SA 0.745±0.054;pcDNAI/Amp/SA 0.825±0.1209,P＞0.05〕。空载体转染组的测定值为0.115±0.0558。
