【 摘要 】目的研究重组人巨噬细胞集落刺激因子(rhM-CSF)对化疗损伤小鼠骨髓造血功能恢复的作用。方法用环磷酰胺100mg/kg连续3天给予小鼠腹腔注射，造成化疗损伤模型。继以不同剂量(0.1～2.0μg/天)的rhM-CSF连续7天给小鼠腹腔注射治疗。在化疗后第5，8，11，14天进行外周血白细胞总数及中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的计数；并在化疗后第7天进行骨髓CFU-GM的集落培养。数据均采用±s，用t检验比较差异显著性。结果1.外周血象变化的观察结果显示：化疗后第8天，注射0.5μg以上rhM-CSF治疗组的小鼠外周血白细胞总数非常显著高于对照组(P＜0.01);注射0.1μg以上的rhM-CSF单核细胞数和中性粒细胞数在化疗后第8天非常显著高于对照组(P＜0.01)；其中以1.0μg剂量组的效果最佳。2.化疗后第7天骨髓GM-CFU集落形成能力对照组集落数显著低于0.5μg以上剂量的rhM-CSF治疗组，加rhM-CSF作为刺激因子组和加rhM-CSF和G-CSF作为刺激因子组的集落形成能力无明显区别。结论这种家蚕表达的rhM-CSF能促进化疗损伤小鼠造血功能的恢复，为其应用于临床治疗白细胞减少性疾病提供了实验依据。

Acceleration of hematopoietic recovery of chemotherapeutically lesioned mice by recombinant human macrophage colony-stimulating factor expressed in silkwormOUYANG Jian, SUN Jin, QIN Junchuan, et al. Nanjing Gulou Hospital, Nanjing 210008

【 Abstract 】ObjectiveTo investigate the effect of rhM-CSF on hematopoietic recovery of chemotherapeutical lesions.Methods100mg/kg CTX were ip injected into mice for 3 consecutive days to make the model of chemotherapeutical lesions. Mice were also ip injected with rhM-CSF at doses of 0.1-2.0μg/day following the injection of CTX.Results1. Observation of the peripheral hematological changes showed: The peripheral white blood cell count of treatment group(0.5-2.0 μg/day rhM-CSF) was significantly higher than that of the control group at day 8 (P＜0.01). Monocyte and granulocyte counts of treatment group(0.1-2.0 μg/day rhM-CSF) were significantly higher than those of the control group at day 8(P＜0.01). Among which, 1.0 μg/day rhM-CSF was most active. 2. On day 7, the bone marrow CFU-GM yield of control group was significantly lower than that of treatment group, and no evident difference was found between the effect of rhM-CSF and rhM-CSF plus G-CSF as stimulating factor.ConclusionrhM-CSF could accelerate hematopoietic recovery in chemotherapeutically lesioned mice.

【 Subject words 】Recombinant human colony-stimulating factorHematopoietic recoveryCyclophosphamideMice

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是一种重要的造血生长因子，不仅能刺激骨髓干细胞分化、发育成单核巨噬细胞，并能促其增殖、生存，还能刺激效应细胞(巨噬细胞、粒细胞等)成熟后的功能，如增强巨噬细胞的吞噬、杀伤活性及其介导的抗体依赖的细胞毒效应等^〔1～3〕。M-CSF单独或与其它造血因子联合应用在多种血细胞减少症、造血功能受损及与此相关的免疫功能低下等疾病的治疗，有广泛的应用前景。

南京大学医药生物技术国家重点实验室的研究人员在国内外首次成功实现了rhM-CSF在家蚕系统中的高效表达，并获得了大量、高纯度的M-CSF制剂。由于人和小鼠的M-CSF cDNA有70%的同源性，缺乏种属特异性^〔4，5〕。据此，我们利用小鼠的大剂量化疗损伤模型研究rhM-CSF的疗效，为其应用于临床提供实验依据。

材料与方法

1.实验动物：普通级昆明种小鼠，8周龄，体重18～22g。雌、雄各半。由江苏省实验动物中心提供。随机分为对照组、0.1μg治疗组、0.5μg治疗组、1.0μg治疗组、2.0μg治疗组。每组12只小鼠。

2.化疗方法：环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产。剂量为100mg/kg，腹腔注射，每天1次，连续3天。

3.rhM-CSF：由南京大学生化系提供，其制备方法见文献〔4，5〕。将带有天然信号肽和N端1～149氨基酸密码子的人M-CSF基因插入家蚕核型多角体病毒转移质粒，经体内同源重组获得高效表达rhM-CSF的重组病毒；以10μl(10⁵PFU)/虫腹部注射感染5日龄家蚕幼虫，饲养4天后剪腹足，8000转/分离心收集家蚕血淋巴，从其血淋巴液中提取纯化的rhM-CSF。比活为5×10⁷U/mg。

4.化疗后处理及外周血象变化的观察：治疗组小鼠于化疗结束后第一天开始，腹腔注射rhM-CSF，每天给药剂量分别为0.1,0.5,1.0,2.0μg/只。对照组腹腔注射等体积的生理盐水，连续注射7天。于化疗前及化疗后第5，8，11，14天分别取尾静脉血，用Coulter Ac.T血细胞分析仪进行白细胞、血小板计数，测定血红蛋白含量，并涂片经瑞氏染色，进行白细胞分类计数。

5.骨髓CFU-GM集落形成能力的测定：参照文献〔6〕的方法，于化疗后第7天脱颈椎处死小鼠，取股骨收集骨髓细胞，用RPMI 1640调节细胞浓度至10⁶ cells/ml。按下列比例配置半固体胶：40%马血清，40%RPMI 1640，10%的骨髓细胞，10%的3.3%琼脂。每组设空白对照组、加rhM-CSF(150U)组、加rhM-CSF+G-CSF(各150U)组。G-CSF即市售惠尔皿(商品名)，由日本麒麟啤酒公司生产。在每个35mm的玻璃平皿中加入上述单位的刺激因子后，再加入1ml胶，迅速混匀，于37℃，5% CO₂，饱和湿度下培养7天后，进行集落计数(＞50个细胞为一个集落)。

6.统计分析：数据采用±s表示，用t检验比较差异显著性。

结果

1.不同剂量的rhM-CSF对化疗损伤小鼠外周血白细胞恢复的作用：经大剂量环磷酰胺化疗后，小鼠外周血白细胞总数在化疗后第5天降至谷值。化疗后第8天就有明显的回升，其中0.5μg剂量rhM-CSF的治疗组就开始显效，而1.0μg的rhM-CSF治疗组外周血白细胞的恢复速度最快，在化疗后第8和11天其白细胞计数分别为(15.82±4.54)×10⁹/L和(14.60±3.29)×10⁹/L，非常显著高于对照组的(7.87±2.13)×10⁹/L和(10.01±2.09)×10⁹/L(P＜0.01)。而0.1μg的rhM-CSF治疗组小鼠在化疗后第8和11天白细胞计数分别为(9.54±1.63)×10⁹/L和(10.23±1.59)×10⁹/L，同对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。化疗后第14天，各组均恢复至化疗前的白细胞水平(图1)。

图1不同剂量rhM-CSF对化疗损伤小鼠外周血白细胞恢复的作用

Fig 1. Effect of rhM-CSF on WBC recovery in chemotherapeutically lesioned mice

**P＜0.01,compared with control

外周血白细胞分类计数显示，在化疗后第5天单核细胞、中性粒细胞降至谷值。化疗后第8天就有明显的回升，其中0.1μg组就开始显效，以1.0μg的rhM-CSF治疗组效果最好。在化疗后第8和11天1.0μg的rhM-CSF治疗组小鼠单核细胞计数分别为(3.63±0.64)×10⁹/L和(2.80±0.87)×10⁹/L;中性粒细胞计数分别为(10.15±1.67)×10⁹/L和(7.36±1.89)×10⁹/L，均非常显著高于对照组的单核细胞计数(1.18±0.32)×10⁹/L和(1.26±0.34)×10⁹/L；中性粒细胞计数(1.25±0.82)×10⁹/L和(2.46±1.08)×10⁹/L(P＜0.01)。化疗后14天，除1.0μg组单核细胞数显著高于对照组外，其余各组均恢复正常水平(图2，3)。

图2不同剂量rhM-CSF对化疗损伤小鼠外周血单核细胞恢复的作用

Fig 2. Effect of rhM-CSF on peripheral monocyte recovery in chemotherapeutically lesioned mice

*P＜0.05,compered with control

**P＜0.01,compered with control

图3不同剂量rhM-CSF对化疗损伤小鼠外周血中性粒细胞恢复的作用

Fig 3. Effect of rhM-CSF on peripheral neutrophil recovery in chemotherapeutically lesioned mice

*P＜0.05,compared with control

**P＜0.01,compared with control

淋巴细胞计数结果显示，对照组和0.1μg的rhM-CSF治疗组在第5