【 摘要 】目的拟借助微粒体膜和体外转录翻译系统来研究分泌型TNFα(S-TNF-α)的产生机制及S-TNF-α和跨膜型TNFα(TM-TNF-α)的关系。方法首先将分子量为17×10³ S-TNF(不含编码TNF信号肽的基因)、26×10³ TM-TNF（含信号肽基因）和17×10³ S-TNF突变体（S-TNFm，用IL-2信号肽密码子置换TNF信号肽序列）的全长cDNA片段分别亚克隆于含T7启动子的pGEM-3Zf载体，然后利用体外转录翻译系统，在微粒体膜存在和不存在的情况下，体外翻译合成S-TNF、TM-TNF及其S-TNFm。结果经Western blot 分析结果表明：微粒体的存在并不改变26×10³ TM-TNF的分子量，但微粒体的存在能将S-TNFm上的IL-2信号肽切除，证实TNF引导序列与一般分泌性蛋白的“信号肽”不同，在粗面内质网翻译过程中不被切除。进一步酶切分析表明TM-TNF是通过某些金属蛋白酶酶解作用而被转换成S-TNF的。结论实验结果提示17×10³ S-TNF产生机制可能是：TNF产生细胞经LPS等激活后，导致TNF基因转录翻译增加，首先形成26×10³ TNF，并借助其信号肽疏水氨基酸部分将之“锚定”在细胞膜，成为跨膜型TNF，介导细胞与细胞之间的生物学效应；在某些蛋白酶作用下，可将mTNF的“信号肽”切除，产生17×10³分泌型TNF，释放至体液中，在局部或全身发挥作用。

The differences between mechanisms of TNF-α synthesis and secretion and typical secretory proteinZENG Jinyang, LI Zhuoya, GONG Feili,et al.Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030

【 Abstract 】ObjectiveActivated monocytes/macrophages may express two different molecular forms of TNF-α, a secretory 17kD form S-TNF-α and a tansmembrane 26kD form TM-TNF-α. It is however still a matter in dispute whether 26kD TNF is present as an integrated protein on the cell membrane.The present study is to explore the mechanisms underlying the production of S-TNF-α and the interrelation between these two forms of TNF-α.MethodsFull length cDNA fragment of S-TNF(without genes encoding TNF signal peptide), 26kD TM-TNF(with gene encoding signal peptide) and S-TNF mutant(S-TNFm, in which TNF signal peptide sequence had been displaced by that of IL-2) were subcloned respectively into the vector pGEM-3Zf containing a T7 promoter, respectively. S-TNF, TM-TNF and S-TNFm were then in vitro translated and synthesized in the presence or absence of microsomes.ResultsAs shown in Western blot analysis, the presence of microsomes did not alter the molecular weight of TM-TNF , but it did result in the cleavage of the IL-2 signal peptide from S-TNFm,suggesting that the leader sequence of TNF might differ from the signal peptide of typical secretory protein in that it seemed not to have undergone cleavage during translation in the rough-faced endoplasmic reticulum. Further enzymatic analysis revealed that TM-TNF was converted into S-TNF through the effect of certain metalloproteinase.ConclusionsThese results suggest that the mechanisms of TNF-α production may be as follows: Activation of TNF-α producing cells by LPS leads to augmented transcription/translation of TNF-α gene, resulting firstly in the formation of 26kD TNF-α , which is then anchored to the cell membrane as a protein with the aid of the hydrophobic amino acids of its signal peptide. This transmembrane TNF-α serves to mediate biological activities through direct cell-to-cell contact. Under the action of certain proteinase, signal peptide of TNF may be cleaved from the TM-TNF, resulting in the formation of 17kD secretory TNF-α,which is released into the body fluids, exerting its effect locally or systemically.

【 Subject words】TNF-αin vitro transcriptionin vitro translationSignal peptide

激活的单核/巨噬细胞能表达分泌型相对分子质量(17×10³)及跨膜型相对分子质量(26×10³)TNF-α^〔1〕,但对于26×10³ TNF是否以完整跨膜蛋白形式存在于细胞膜上还存在争议。Peck等认为该蛋白可能是一种外周膜蛋白，而非镶嵌膜蛋白^〔2〕。Krigler等提出TM-TNF是S-TNF的前体^〔3〕。这是否表明S-TNF同其它分泌型蛋白一样，在蛋白合成中其前体的信号肽在内质网被切除，继而成为成熟蛋白分泌至胞外。为了探讨这个问题，我们借助微粒体膜和体外翻译系统来研究S-TNF的产生机制及两型TNF的关系。

材料与方法

1. 质粒、菌株： 质粒pGEM-3Zf购自美国Promega公司; 重组质粒pBSK-S-TNF(仅包含编码无“信号肽”的TNF结构基因序列),pBSK-TM-TNF(含编码TNF结构蛋白的基因序列，包括“信号肽”), pBSK-S-TNFm(将IL-2信号肽置换TNF-α引导序列的重组突变体)均由本实验室构建。大肠杆菌 E.coli JM109由本校实验中心分子生物学教研室提供。

2. 化学试剂及酶类： 体外转录系统、体外翻译系统、非同位素体外翻译检测系统、T4 DNA连接酶、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、 限制性内切酶(美国Promega公司)；犬胰腺微粒体，m⁷G(5')ppp(5')G(德国Boehringer Mannheim公司)；IPTG、X-gal、RNase、MTT、硝酸纤维素膜(美国Sigma公司)；重组TNF标准品、抗TNF单抗、辣根过氧酶标抗体(北京邦定公司)。

3.体外表达重组质粒的构建：碱变性法小量抽提pBSK-S-TNF、pBSK-TM-TNF、pBSK-S-TNFm三种重组质粒, 经Hind Ⅲ/BamH Ⅰ双酶切，从琼脂糖凝胶中回收纯化3种TNF cDNA片段,方法参照文献〔4〕，分别与载体pGEM-3Zf/Hind Ⅲ，BamH Ⅰ连接,并转化至大肠杆菌JM109，在含有 Amp及X-gal/IPTG的LB琼脂平板上，选择带有外源基因的白色转化菌落，得到pGEM-3Zf-S-TNF、pGEM-3Zf-TM-TNF, pGEM-3Zf-S-TNFm三种重组质粒。

4. pGEM-3Zf-TNF重组质粒的体外转录： 用内切酶Hind Ⅲ将pGEM-3Zf-S-TNF、pGEM-3Zf-TM-TNF, pGEM-3Zf-S-TNFm三种重组质粒线性化, 按照体外转录系统试剂盒说明书操作，在T7 RNA 聚合酶的作用下将质粒DNA体外转录成带帽mRNA。

5. 体外翻译合成TNF蛋白： 按兔网织红细胞裂解物体外翻译试剂盒操作指南进行体外翻译,并用tRNAnscend^TM tRNA作为体外翻译合成特异性蛋白产物的标记物，分别在犬胰腺微粒体存在和不存在的条件下体外合成TNF。设β-内酰胺酶mRNA的体外翻译系统作为对照。

6. 体外翻译产物的Western-blot分析： 取适当体外翻译产物进行15% SDS-PAGE；然后采用半干电转移法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维膜上；借助非同位素体外翻译检测系统，通过显色反应鉴定出体外翻译的特异性产物。

结果

1. TNF cDNA的鉴定： 为证实三种重组质粒中包含有相应的TNF cDNA片段，分别用扩增S-TNF，S-TNFm和TM-TNF的专一性引物对重组质粒进行PCR扩增，PCR扩增产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示。可见三型TNF cDNA条带清晰。S-TNF cDNA片段最小，为480bp；TM-TNF cDNA片段最大，为718bp；S-TNFm cDNA条带位于515bp之后，并滞后于S-TNF。说明三种TNF cDNA片段均与理论值一致。然后以这三种重组质粒为模板，经线性化处理后在T7 RNA 聚合酶的作用下，分别转录出3种类型的加帽TNF mRNA片段。

图1S-TNF,S-TNFm, TM-TNF PCR扩增产物电泳分析图谱

Fig 1. 0.8% electrophoresis analysis about PCR specific products of different types of TNF

1. λDNA/Hind Ⅲ +EcoR Ⅰ marker, 2. PCR marker, 3.S-TNF PCR products, 4. S-TNFm PCR products,5. TM-TNF PCR products

2.在体外翻译系统中表达TNF蛋白： 采用兔网织红细胞体外翻译系统，在有或无犬胰腺微粒体膜存在的条件下，分别在体外翻译合成TM-TNF、S-TNF及S-TNF突变体,并以β-内酰胺酶(β-lactamase) 与微粒体膜共翻译产物作为对照。

通过ELISA、生物学活性检测及TNF-α单抗阻断分析，证实体外翻译产物为具有生物学活性的TNF-α（结果略）。进一步通过Western blot分析，结果如图2。在无微粒体存在下β-内酰胺酶翻译产物仅在约31×10³处有一条带（泳道2)，此为内酰胺酶前体蛋白，而有微粒体存在的翻译产物，除在31×10³处有一浅带外，可见一条相对分子质量较小的片段约28×10³（泳道3)，表明内酰胺酶前体在与微粒体的共翻译中，其信号肽脱落，降解为成熟肽。比较微粒体存在和不存在的体外翻译产物TM-TNF的相对分子质量（泳道4，5），可见它们均在同一位置上（约26×10³)，未见其