【 摘要 】目的构建HCV 5'NCR片段调控荧光素酶表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法 通过PCR扩增，获得中国人HCV基因组5'非编码区（noncoding region, NCR）完整序列与C区部分序列的目的基因片段（5'NCR-C片段）。将此片段插入pGL3荧光素酶报告载体的荧光素酶基因起始密码上游，构建受5'NCR 片段调控的荧光素酶表达质粒。应用脂质体介导基因转染技术将8个质粒转染HepG2肝癌细胞。结果经鉴定获得8个均为正向插入的阳性克隆。序列分析结果表明插入片段与中国人HCV（Ⅱ型）序列基本一致，其荧光素酶基因起始密码子已去除且未改变编码框。有一个质粒能够表达荧光素酶活性，其绝对值达1141.9±151.1 mV，是pGL3报告载体荧光素酶活性的20%。结论当质粒1μg、Lipofectin 6μl,Lipofectin-质粒复合物与细胞孵育4小时时可获得最佳转染效果。

Construction of the plasmid expressing luciferase controlled by HCV 5' NCR region and its expression in HepG2 cellWANG Xiaohong*, WANG Shengqi, LI Mengdong, et al. *Southwest Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400038

【 Abstract 】ObjectiveTo establish an in vitro screening system for testing effects of antisense drugs targeting at 5'NCR-C of HCV genome.MethodsIn order to construct the plasmid expressing HCV-luciferase fusion RNA, the target gene fragment(5'NCR-C) composed of intact 5'NCR and partial C region of Chinese HCV genome was obtained with PCR amplification and was inserted into pGL3 luciferase reporter vector in which the start codon of luciferase gene had been deleted. The structure and function of constructed plasmid were confirmed by PCR, DNA sequencing and liposome-mediated transient expression in HepG2 cells.ResultsDNA sequencing showed that the inserted sequence of the constructed plasmid was the same as that of Chinese HCV genome, the start codon of luciferase gene was deleted and the reading frame of luciferase gene was not changed. The HepG2 cells transfected with constructed plasmid could express luciferase activity which was up to (1141.9±151.1)MV and reached 20% of the luciferase activity of pGL3 reporter vector. The best transfection efficiency was obtained with the plasmid 1μg, Lipofectin 6μl and 4 hours incubation of Lipofectin-plasmid complexes with cells.ConclusionsThe results showed that the author successfully constructed the plasmid expressing luciferase gene controlled by HCV 5'NCR and established an in vitro testing system for screening HCV-RNA 5'NCR and C gene specific nucleic acid drugs.

【 Subject words 】 Hepatitis C VirusLuciferasepHCV-luc09HepG2 cells

丙型肝炎病毒（HCV），是输血后肝炎的主要致病因子。HCV感染后，60%的感染者发展为慢性肝病，其中20%在10年内发展为肝硬化。HCV感染还与肝细胞癌的发生密切相关，目前α-干扰素是最常用的抗HCV药物，但有效率仅为(10～25)%。由于缺乏合适的HCV感染小动物模型及细胞模型，从而限制了抗HCV药物的评价。随着分子生物学技术及反义核酸技术的发展，从基因水平探索特异性抗HCV药物已成为可能。国外已有HCV全长序列或部分序列体外转染培养细胞建立药物评价系统的研究报道^〔1-4〕，但定量困难。国内尚未见这方面的资料。本研究旨在构建HCV 5'NCR调控荧光素酶表达的质粒，建立一种针对HCV基因的特异性反义药物体外定量评价系统，为反义核酸药物抗HCV研究创造条件。

材料与方法

1.HCV-RNA 5'NCR-C区片段制备(图1)

图1HCV 5'NCR调控荧光素酶表达质粒的构建

Fig 1. Construction of plasmid expressing luciferase controlled by HCV 5'NCR

(1) 模板：pHCV376（军事医学科学院王升启博士构建），含有HCV RNA 5'NCR及C区部分序列（第25～400nt）。

(2) 引物设计与合成：根据中国人HCV基因组^〔5〕（Ⅱ型）序列，设计合成一对引物，上游引物H1（5'GCATCAAGCTTGCCAGCCCCCGATTGGGG

GCGACACTCCACCATGAATCA 3'，50个nt）含有HindⅢ酶切位点及HCV基因组1～39位核苷酸（nt），下游引物H2（5'AACGATCTGACCACCACCCCGGAACTTGACGTCCTGTGGGCG

GCGGTTG3,49个nt）位于HCV 基因组第419～386位核苷酸，引物采用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。

(3) PCR扩增：反应体系20μl，含10×PCR缓冲液2μl（Promega公司产品），dNTPs 0.2mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，引物H1及H2各0.1μg，pHCV376 0.1μl，Taq酶0.5U（Promega公司产品），石蜡油20μl。PCR反应条件为94℃变性30秒；72℃延伸40秒；60℃退火10秒；循环35次后72℃延伸10分钟。扩增产物采用1.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，并用PCR产物纯化试剂盒（Promega）纯化。纯化产物用Klenow大片段（华美生物工程公司）处理后进行纯化及 HindⅢ酶切。

2. 质粒构建： 如图1所示，将pGL3载体采用NcoI（Promega）酶切，绿豆核酸酶（华美生物工程公司）削平，再用HindⅢ酶切。每次酶切后均用酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提及乙醇沉淀。最后用0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化，去除切割下的小片段。载体与5NCR-C片段的连接及转化参照《分子克隆》，插入片段与载体的摩尔比为 6∶1，感受态细胞为Promega公司产品。

3. 克隆鉴定

(1) PCR鉴定：在pGL3 control vector上5'NCR-C插入片段两侧各合成1条引物，上游引物G1序列为5'AGAAGTAGTGAGGAGGCTT T3'(20nt)，下游引物G2序列为5'AGAATGGCGCCGGGCCTTTC3'(20nt) ，用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。采用不同的引物组合进行菌体PCR扩增鉴定。载体引物G1-G2组合，鉴定是否为阳性克隆。载体5'端引物G1与插入片段3'端引物H2组合及载体3'端引物G2与插入片段3'端引物H2组合，鉴定插入片段的方向。

(2)序列分析：采用Promega公司Wizard minipreps DNA purification system及fmol DNA sequencing system 按说明书操作进行质粒提取和序列分析。

4. 质粒在HepG2细胞中的表达

(1) 细胞培养：HepG2肝癌细胞由军事医学科学院微生物与流行病研究所王海涛研究员惠赠。采用DMEM培养基(含10%小牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)，在37℃，5% CO₂条件下进行培养及传代。

(2) 质粒转染：HepG2肝癌细胞接种于24孔板（Costar），0.5×10⁵/孔，(70～80)%细胞融合后，采用脂质体Lipofectin(1mg/ml，Life Technologies公司产品)试剂盒进行转染并按说明书操作。每次实验均做双孔。

(3) 荧光素酶活性检测：采用荧光素酶测定试剂盒（Luciferase assay system，Promega）及推荐的操作步骤进行。化学发光仪为 LKB公司的 Wallac 1250 Luminometer，输出值为毫伏（mV）。

(4) 转染条件的优化：取不同剂量(2～10μl)的Lipofectin及pHCV-luc09质粒1μg混合后与细胞一起孵育5小时进行转染，以确定Lipofectin的最佳浓度。取不同浓度pHCV-luc09质粒(0.25～4μg)及Lipofectin 6μl，混合后孵育5小时转染，以确定最佳质粒浓度。采用不同孵育时间(2～12小时)及pHCV-luc09质粒1μg和Lipofectin 6μl进行转染，以确定最佳孵育时间。

结果

1.HCV RNA 5'NCR-C片段的特异性：根据设计的引物，PCR产物（5'NCR- C片段）的扩增长度为430bp，实际扩增片段经琼脂糖电泳分析与设计长度一致（图2），由此获得含有5'NCR 完整序列及C区5'端25个密码子的目的基因片段，其上游含有HindⅢ酶切位点。

图2HCV 5'NCR-C片段的PCR扩增

Fig 2. PCR amplification of HCV 5'NCR-C fragment

A.DNA marker(pBR344/HinfⅠ)

B.PCR product

2. HCV RNA 5'NCR-C片段克隆的鉴定

阳性克隆鉴定：转化菌落共35个；分别挑取少许菌体进行PCR扩增；阳性克隆的限制扩增片段长度为509bp；结果显示，8个克隆扩增出与设计长度一致的阳性条带即509bp条带(图3)。

图3阳性克隆的PCR鉴定

Fig 3. Identification of positive clones by PCR