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摘要：目的研究牛磺酸对神经细胞c-fos基因表达的影响，以期从信号传导的角度探讨牛磺酸促进神经系统生长发育、增殖分化，增强动物学习记忆能力的机制。方法本实验利用图像分析仪通过免疫细胞化学的方法， 分别对培养的大鼠海马神经元和整体动物脑神经细胞c-fos基因表达的影响进行了分析。结果牛磺酸浓度在0.4～6.4 mol/L时，Fos免疫反应阳性(Fos-like immunoreactivity, Fos-LI)神经元百分率较对照组(加入等量生理盐水)明显增高，表明牛磺酸能增加Fos-LI神经元细胞数。对Fos-LI神经元细胞进行图像分析，测其平均光密度，发现0.1～6.4 mmol/L牛磺酸可明显增高Fos-LI神经元细胞的光密度，表明牛磺酸能够增加Fos蛋白产生的量，即增加c-fos基因表达的强度。整体动物实验发现，牛磺酸可诱导大鼠脑神经细胞c-fos基因快速表达，合成Fos蛋白。Fos-LI胞核主要分布于颞叶、下丘脑等区域，在海马主要分布于CA4和CA1区。而这些脑区与学习记忆密切相关，这对于探讨牛磺酸提高大鼠学习记忆的机制有重要意义。结论牛磺酸不仅能增加海马神经元细胞的Fos-LI百分率，还在一定程度上增强c-fos基因表达的强度。这可能是牛磺酸增强动物学习记忆的原因之一。
中图分类号：R741文献标识码：A
文章编号：1006-2963(2000)01-052-06
Effect of Taurine on the Expression of Fos Protein
in Neuronal Cells in Rats
AN Wen-linLI LinLI Bin
(Beijing Geriatric Clinical and Research Center, Capital University of Medical Sciences, Xuanwu Hospital, Beijing 100053）
ZHANG Hong-wei
（Department of Nutrition & Food Hygiene, Capital University of Medical Sciences,
Beijing 100054）
LU De-hong
（Department of pathology, Xuanwu Hospital, Beijing 100053, China)
ABSTRACT：ObjectiveThe present study was carried out to investigate the effect of taurine on the expression of c-fos gene whose products are regarded as the third messengers in signal transduction, to reveal its mechanism in promoting the learning and memory ability.MethodsThe primary cultured hippocampal neuronal cells from neonatal rats were incubated with various doses of taurine for 90 min. The number of Fos-LI neuronal cells were counted, and opticaly density of Fos-LI neuronal cells were detected by image analyzer. As for investigating the effect of taurine on the expression of c-fos gene in rat brain, saline or various doses of taurine had been injected intraperitoneally.ResultsIt showed that taurine enhanced the expression of c-fos gene and increased the number of Fos-LI neurons.ConclusionsOur results indicate that taurine increase the expression of c-fos gene and synthesis of Fos protein in rat. Fos-LI neuronal cells were distributed at the auditory area of temporal cortex, hypothalamus, hippocampus, etc., most of which are related to the memory and learning functions. These results shed light on a better understanding of the mechanism of taurine in increasing learning and memory abilities.
Key words： taurine; Fos protein; neuronal cells; immunochemistry
牛磺酸是一种条件必需氨基酸，与中枢神经系统正常生理功能的维持有密切关系。已有实验证实，牛磺酸具有促进神经系统生长发育、增殖分化，增强大鼠学习记忆的作用［1～3］。而Fos蛋白是真核细胞的调控因子，c-fos基因的表达和Fos蛋白的生物合成对于易化学习记忆过程至关重要，它不仅参与细胞的信息传递过程，而且在细胞正常生长、分化方面有重要意义。为了研究牛磺酸对神经细胞c-fos基因表达的影响，以及对整体动物神经细胞的作用，本实验利用图像分析仪，通过免疫细胞化学的方法分析了牛磺酸对培养的新生大鼠海马神经元和整体动物脑神经细胞c-fos基因表达的影响，以期从信号传导的角度揭示牛磺酸促进神经系统生长发育、增殖分化及增强动物学习记忆能力的机制。
1材料和方法
1.1 试剂和仪器牛磺酸为Sigma公司产品，N3购自军事医学科学院基础所，Fos多克隆抗体(兔抗c-fos sc-52)、ABC Kit(PK-4001)、封闭用正常羊血清均购自北京中山试剂公司，胰蛋白酶、DMEM为美国GIBCO公司产品。
超净工作台、CO2培养箱为美国SHELL/JB Tc2323, 彩色细胞图像分析仪为同济医科大学太阳科技公司生产，TJTY-400型。
1.2 方法
1.2.1培养的新生大鼠海马神经元细胞Fos蛋白的测定： 按照王福庄等神经细胞的培养方法［4］略加改进，将神经细胞培养在盖玻片上，当神经细胞生长至第8～11天(d)时，向培养液中加入不同剂量的牛磺酸，以加入生理盐水作为空白对照，然后放入CO2培养箱中继续培养。90min后，以40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入1∶200正常兔血清，在37℃温育1 h后直接换入抗Fos血清(选用抗体滴度1∶500)，4℃下放置24 h。以后操作为ABC显色，甘油明胶封固，光镜下记录Fos免疫反应阳性(Fos-LI)神经元细胞数，每张玻片计数10个视野，并用图像分析仪对阳性细胞进行光密度分析。
1.2.2大鼠不同脑区Fos蛋白表达的测定： (1) 动物及分组：选用健康SD雄性大鼠60只，体重250～300g。实验前10 d，每天对大鼠进行捉抓，称重，腹腔注射生理盐水(1 mL/100g)，使大鼠适应实验中可能出现的应激刺激。随机分组如下： 1) 时效关系：按体重腹腔注射牛磺酸12.5 mg/kg，从给药始动物存活0.5、1、2、4和8 h 5个时程点，每时程点动物数(n)=6。对照组腹腔注射生理盐水(NS)，n=6。2) 量效关系：实验组按体重腹腔注射牛磺酸剂量分别为3.125、12.5、50 mg/kg，对照组腹腔注射等量生理盐水(NS)，从注射始动物存活2 h。每个剂量组n=6。 (2) 灌注固定及取材：从给药始到预定存活时间，深度麻醉下经心脏-升主动脉插管，剪开右心耳，用输液泵以生理盐水约200 mL冲灌，再以福尔马林灌流固定动物。开颅取全脑，再置于福尔马林中4℃下进行后固定，20～24 h后移入质量浓度为300 g/L蔗糖溶液5～6 d。自蔗糖中取出脑组织，用0.01 mol/L PBS冲洗，额状面冰冻切片，片厚40 μm，收集于PBS(0.01 mol/L)中。 (3) 免疫反应(ABC飘浮法)：切片用PBS(0.01 mol/L, pH7.4)充分漂洗后，加入1∶500正常羊血清(用体积分数0.3% TritonX-100/0.01 mol/L PBS稀释)于37℃、 1 h后，直接换入1∶500抗Fos血清(用体积分数0.3% Triton X-100/1 g/L BSA/0.01 mol/L PBS)，在4℃放置18～24 h。充分漂洗后切片入1∶200生物素化二抗(羊抗兔血清)于37℃温育1 h。漂洗后将切片放入体积分数0.3% H2O2与甲醇混合液，室温下放置30 min(以消除内源性过氧化物酶)。充分漂洗后切片入1∶100亲和素-生物素-HRP复合物，于37℃温育1 h。漂洗后加入含体积分数0.01% H2O2和0.5 g/L DAB(3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐、3，3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)的Tris-HCl缓冲液(0.05 mol/L, pH7.6)显色2～6 min，自来水冲洗终止反应。用0.5 g/L铬明矾明胶顺序贴片，自然干燥后，上行梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下对不同脑区Fos-LI神经元细胞进行计数。结果用均数±标准差(±s)表示，统计用SPSS软件包，两两比较采用Student′s t检验，组间比较采用方差分析(ANOVA)及进一步的Student-Newman-Keul′s检验。
2结果
2.1 牛磺酸对培养的海马神经细胞c-fos基因表达的影响通过免疫细胞化学的方法，测定c-fos基因产物Fos蛋白，间接反映c-fos基因的表达情况。神经元细胞胞体内着色深的部位为特异性染色的Fos蛋白(图1)，阴性细胞则整个胞体都被染成淡黄色(图2)。
不同浓度牛磺酸与培养的海马神经元细胞Fos-LI阳性百分率有一定的剂量反应关系，牛磺酸浓度在0.4～6.4 mol/L时Fos-LI百分率较对照组(加入等量生理盐水)明显增高(图3)，表明牛磺酸能增加Fos-LI神经元细胞数。
图3牛磺酸对Fos-LI神经元百分率的影响
Fig 3Effect of taurine on the percentage of Fos-LI neurons in rat hippocampal cells cultured for 8 days
Cells were incubated with various dosages of taurine for 90 min. Fos-LI neurons were counted under optical microscope. Results were expressed as
