关键词: 神经营养素；免疫组化；原位杂交；脾；小鼠

摘要目的在蛋白和基因水平进行神经营养素-3 (NT-3) 及其高亲和力受体 TrkC 的小鼠脾定位研究。方法免疫组织化学和原位杂交。结果脾内存在 NT-3、 TrkC 免疫反应阳性 (-ir) 细胞和 mRNA。 NT-3-ir 细胞属于网状细胞， 主要散布于动脉周围淋巴鞘 (PALS)、 淋巴小结和血管内壁。 TrkC-ir 细胞则分布于边缘区和红髓， 细胞性质有待确定。 原位杂交实验证实， NT-3 mRNA 和 TrkC mRNA 分别与相应的免疫反应阳性细胞有一致的分布。 免疫组化和原位杂交对照实验均为阴性。结论NT-3 和 TrkC 能够被脾内不同的细胞合成， 提示 NT-3 有可能具有调节脾功能的作用。

中图号R322.21R392.1

The Distribution and Gene Expression of Neurotrophin-3 in

the Spleen of Mouse

Yang HongYang QingfengZhou ChangmanJu GongFan Ming

(Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850)

Objective and Method The distribution of NT-3/TrkC immunoreactive (ir) cells and NT-3/TrkC mRNA in the spleen of BALB/c mice were studied using immunohistochemical and in situ hybridization methods.Results The result showed that both NT-3/TrkC-ir cells and mRNA were present in the spleen. NT-3-ir cells belonged to the stroma cells of spleen and scattered mainly in the periarterial lymphoid sheath (PALS), lymphatic follicles and the inner wall of the blood vessels. While TrkC-ir cells were found only in the marginal zone and red pulp, although the characteristic of TrkC-ir cells were remained to be identified. NT-3 mRNA and TrkC mRNA showed a very similar distribution pattern with their corresponding immunoreactive cells as revealed by in situ hybridization. The control experiment for both immunohistochemistry and in situ hybridization showed a negative staining.Conclusion The present study indicated that both NT-3 and TrkC could be synthesized by different cells of spleen, which suggested a possible regulation effect of NT-3 on the function of spleen.

Key words neurotrophic factor；immunohistochemistry；in situ hybridization；spleen；mouse

近年来不断积累起来的研究结果表明， 传统概念上主要作用于神经系统的神经营养因子也具有免疫调节作用。 这一发现为研究神经-免疫两大系统之间的相互调节开辟了新的领域。 神经营养因子在免疫系统的合成和免疫细胞上神经营养因子受体的表达， 是它们发挥功能作用的先决条件。 目前研究较清楚的是神经生长因子 (NGF)。 已知 NGF 能够在免疫器官合成， 而且免疫系统的多种细胞能够表达功能性的 NGF 受体^［1，2］。

NT-3 是 NGF 家族的另一神经营养因子， 对交感神经元和神经脊来源的感觉神经元有着与 NGF 相似的促生长发育和促存活作用。 NT-3 的生理作用是通过与酪氨酸激酶受体 TrkC 结合而实现的。 近来有报道， NT-3 和 TrkC mRNA 存在于免疫器官^［3］， 但其细胞定位和功能尚不清楚。 本实验应用免疫组织化学和原位分子杂交方法， 在蛋白和基因水平研究 NT-3 和 TrkC 在小鼠脾的细胞定位，旨在为探讨该因子的免疫调节作用及机制提供形态学依据。

1材料和方法

1.1免疫组织化学7～8 周的雄性 BALB/c 小鼠 6 只， 体重 20～25 g。 20 g/L 异戊巴比妥钠麻醉， 经左心室灌注 4℃ 的含 40 g/L 多聚甲醛、 0.01% (体积分数) 戊二醛、 0.2% (体积分数) 饱和苦味酸的磷酸缓冲液 (0.1 mol/L PB, pH7.4)。 10 min 后取出脾， 以不含戊二醛的上述固定液于 4℃ 再固定 12～16 h。 沿与脾长轴垂直方向将脾分为 4 等份， 取靠中线的一块自脾门向脾背侧做振动切片， 片厚 30 μm， 收集所有切片于 0.01 mol/L 的 PBS (pH7.4) 中。 常规 ABC 法免疫组化染色， 硫酸镍铵-DAB 法呈色。 特异性抗 NGF、 TrkC 多克隆抗体由美国 Santa Cruz. 公司提供 (工作浓度 1∶500)。

1.2原位杂交

1.2.1探针制备： 地高辛(DIG)标记及检测试剂盒均为Boehringer Mannheim公司产品。 人 NT-3 cDNA 探针的标记采用PCR 法， 引物序列为 5′-TCGGTACCGTACGCGGAGCAT 和 5′-CCTCTAGATTATCATGTTCTTCCGA。大鼠TrkC(5′-GAAGTGGCCGTTATGGTCTG GTTGGCT GTGCCCAGGGCAT TCTTAGCAAT-3′)。TrkC 寡核苷酸探针由军事医学科学院仪器中心合成，以加尾法进行DIG标记。

1.2.2标本制备： 动物处理和切片收集基本同免疫组化。 所不同的是， 灌注液中不加苦味酸和戊二醛， 冰冻切片厚度为 15 μm， 贴于硅化的载片之上。

1.2.3杂交反应： 冰冻切片干燥后， 经 5 mmol/L MgCl₂-0.1 mol/L PBS (pH7.4) 冲洗， 1 mg/L 蛋白酶 K 37℃ 消化 20 min， 0.1 mol/L 甘氨酸-5 mmol/L MgCl₂-0.1 mol/L PBS (pH7.4) 终止反应， 40 g/L 多聚甲醛固定 20 min， 再用含 MgCl₂ 的 PBS 冲洗， 2×SSC 过渡， 梯度酒精脱水， 37℃ 预杂交 1 h［预杂交液： 50% (体积分数) 去离子甲酰胺， 5×SSC， 5×Denhardt 液， 20 g/L SDS， 1 mg/L 变性鲑精 DNA］， 42℃ 杂交 16～20 h (杂交液： 预杂交液加入 100 g/L 硫酸葡聚糖和相应探针； DIG-NT-3 cDNA 探针浓度为 30 μg/L， 需变性； DIG-TrkC 寡核苷酸探针浓度为 1 mg/L， 无须变性， 同时还加入 100 mg/L polyA、 5 mg/L polydA)。 杂交后依次用含 50% (体积分数) 去离子甲酰胺和 1 mmol/L EDTA 的 2×SSC， 37℃， 2×10 min、 1×SSC 55℃， 2×10 min、 0.5×SSC 55℃， 2×10 min 漂洗 (寡核苷酸探针的漂洗均在 37℃ 下进行并适当缩短漂洗时间)， 继之以缓冲液 1 室温漂洗 2 min， 缓冲液 2 室温孵育 30 min， 1∶2500 标记硷性磷酸酶的抗 DIG 抗体室温 2 h， 经缓冲液 1、 缓冲液 3 冲洗后， NBT/X-磷酸盐 (4.5 μL NBT+3.5 μL X-磷酸盐于 1 mL 缓冲液 3 中) 室温闭光显色 10 h， 1×TE 终止反应， 脱水透明封片。

2结果

2.1NT-3免疫组化结果显示， NT-3 免疫反应阳性细胞主要存在于脾白髓， 属于网状细胞。 它们散在分布于动脉周围淋巴鞘 (PALS) 内， 周边较为密集 (图1)。 阳性细胞大小不等、形态不规则， 大多数有形状各异的胞浆突起 (图3)。 在淋巴小结生发中心内有少数阳性细胞， 它们分布稀疏， 有时甚至不可见 (图1)。 圆或椭圆形， 无突起 (图4)， 这类细胞的性质不明。 脾内大、 小血管的内皮细胞也部分呈现 NT-3 免疫反应阳性， 红髓血管周围还常见成群的阳性细胞。 白髓、 红髓的淋巴细胞均呈免疫阴性反应 (图1，3，4)。 原位杂交结果显示， 与 NT-3-ir 细胞相似， NT-3 mRNA 主要分布于脾白髓 (图2)， 于脾红髓和血管内皮也可见分布。

图1NT-3 免疫反应阳性细胞散在分布于

小鼠脾白髓的动脉周围淋巴鞘和淋巴

小结内。 在淋巴小结生发中心内 (*)

有少数阳性细胞

Fig 1NT-3 immunoreactive (ir) cells were scattered in the periarterial lymphoid

sheath and lymphoid follicle of spleen

of mouse. Within the germinal center

(*), NT-3-ir cells were sparse×120

图2分布于脾白髓 (WP) 的 NT-3 mRNA

Fig 2NT-3 mRNA were diffusely distributed

in the white pulp (WP)×120

图3动脉周围淋巴鞘内 NT-3-ir 细胞

的高倍镜下所见

Fig 3High magnification of NT-3-ir cells

in the periarterial lymphoid sheath×1200

图 4淋巴小结生发中心内 NT-3-ir 细胞

的高倍镜下所见

Fig 4High magnification of NT-3-ir cells

in the germinal center×1200

2.2TrkCTrkC-i