关键词: 干扰素；杂交；基因表达；多样性

摘要目的：采用分子杂交及PCR方法，分析鸭α-干扰素基因的表达及多态性。方法：从鸭外周血分离出的单核细胞在体外经PHA（5 μg/ml）刺激不同时间后，提取总RNA。以RT-PCR方法检测鸭α-干扰素（DuIFN-α）mRNA表达状况。引物根据最近公布的DuIFN-α基因序列设计。从鸭外周血单核细胞中提取的基因组DNA经限制性内切酶BamHI, HindIII, PstI, XbaI消化后，以公布的DuIFN-α序列为探针，采用Southern杂交分析DuIFN-α基因的多样性。结果：在未经PHA刺激的鸭外周血单核细胞（PBMCs）中，未检测到DuIFN-α表达；PHA刺激4 h后，即可检测到DuIFN-α表达，一直持续到24 h。基因组DNA限制性内切酶多态性分析表明，PstI酶切后，出现片段大小各异的杂交信号，提示DuIFN-α存在多样性。结论：鸟类α-干扰素基因与哺乳动物类似，也具有多样性。

中国图书分类号R392.11

Analysis of polymorphism and expression of duck interferon-α gene

HUANG Ai-Long

（Institute for Viral Hepatitis of Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400010）

Allison JilbertIeva Kotlarski

（Department of Microbiology & Immunology, University of Adelaide, Adelaide SA5005）

Allison Jilbert

（Infectious Diseases Laboratories, Institute of Medical & Veterinary Science, Adelaide, SA5000, Australia）

AbstractObjective: To analyse polymorphism and expression of duck interferon-α (DuIFN-α) using nucleic acid hybridisation and PCR amplification. Methods: The total RNA was isolated from duck PBMCs stimulated with 5 μg/ml PHA at different timepoint and transcribed to cDNA with oligodT. The expression of DuIFN-α was detected by RT-PCR with primers based on the published sequence of DuIFN-α gene. To analyse the polymorphism of type I DuIFN gene, the genomic DNA isolated from duck PBMCs was digested with BamHI, HindIII, PstI, XbaI respectively and subjected to southern hybridisation with³² P labeled DuIFN-α probe. Results: The data indicated that the DuIFN-α transcript was undetectable in PBMCs without PHA stimulation, but detectable after 4 h stimulation with PHA and last until 24 h. The RFLP analysis of duck genomic DNA showed that the hybridisation signals with varying sizes were occurred in PstI-digested sample, which suggested the presence of other type I DuIFN gene. Conclusion: The type I IFN gene from avian species has a similar expression and polymorphism pattern with its mammalian counterpart.

Key wordsInterferonHybridisationGene expressionPolymorphism

干扰素是一系列具有抗病毒活性和免疫调节功能的细胞因子，其中α-干扰素以其突出的抗病毒效应而备受重视并一直作为临床上治疗慢性乙型肝炎等病毒性疾病的药物。α-干扰素抗病毒作用的机理，虽有众多报道，但其确切机制，仍未阐明。在慢性乙型肝炎治疗中，即使在严格符合治疗指征的病例中，干扰素疗效也仅停留在30%～40%^［1，2］。由于临床研究的局限性，上述干扰素抗病毒作用的机制以及无应答的原因只能通过相关动物模型的研究加以回答。鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染的鸭子模型是目前国内外公认的研究乙型肝炎病毒（HBV）感染的动物模型，也是研究干扰素抗病毒作用机理较理想的实验模型^［3］。基于上述认识，德国学者Schultz最近（1995）在HindIII消化的鸭基因组DNA中，采用ChIFN-α为探针，成功克隆了包含DuIFN-α基因的HindIII片段（2.7 kb），并在鸭原代肝细胞体外培养系统中证实了其抗DHBV的能力^［4］。本文进一步就DuIFN-α基因在体外的诱导表达以及DuIFN-α基因的多样性分析作一简要报道。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1动物6周龄幼鸭，由IMVS医学研究所动物实验中心提供和饲养。

1．1．2质粒质粒616由Schultz博士馈赠。包含完整DuIFN-α ORF区段的pcDNA1.1/Amp，DuIFN-α插入片段大小约为630 bp，可经XbaI, HindIII双酶切回收。用作Southern杂交的探针。

1．1．3引物根据公布的DuIFN-α序列（accession number X84764），在ORF两侧，采用Pdesign软件，设计如下引物：上游引物（position 1 411～1 430）5' CCA CCA CCA CCA GCC ATC TA 3'; 下游引物（position 1 869～1 888）5' GGC TGT AGG TGT GGT TCT GG 3'。

1．1．4培养基HBSS, RPMI1640细胞培养基，由IMVS细胞培养室提供。在培养鸭外周血单核细胞时，用正常鸭血清（NDS）代替小牛血清（FCS）。

1．1．5其它主要化学与分子生物学试剂总RNA提取试剂，包括淋巴细胞分离液，异硫氰酸胍，饱和酚，氯仿等，主要购自Pharmacia，PHA为Sigma公司产品；逆转录试剂盒Retroscript^TM Kit为Amicion公司产品。Taq酶、缺口平移试剂盒为Bresatec公司产品。DNA回收试剂盒为Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit，所有限制性内切酶及蛋白酶K均为Pharmacia公司产品。

1．2方法

1．2．1鸭外周血单核细胞（PBMC）的体外刺激采用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞和红细胞。利用尼龙毛特异性吸附作用，进一步分离鸭T细胞。于24孔细胞培养板中，加入1 ml 8×10⁶ ml^-1上述PBMC，37℃温育1～2 h，使抗原提呈细胞（APC）贴壁。在上述吸附有APC细胞的24孔板中加入分离的T淋巴细胞（8×10⁶ ml/孔）和红细胞（4×10⁶ ml/孔）以及终浓度为5 μg/ml的PHA，37℃孵育，分别于不同时间收集细胞，提取总RNA^［5］。

1．2．2DuIFN-α的RT-PCR检测上述总RNA的逆转录参照Amicion公司说明书进行，引物为OligodT。PCR扩增参数为95℃ 3 min，然后94℃45 s，55℃45 s，72℃1 min，循环35次，最后72℃延伸5 min。

1．2．3鸭基因组DNA提取具体方法详见参考文献［6］。主要包括，TE裂解鸭外周血单核细胞，蛋白酶消化和酚∶氯仿抽提去除蛋白，异丙醇沉淀基因组DNA。

1．2．4Southern杂交基因组DNA经BamHI、HindIII、PstI和XbaI分别消化后，1%琼脂糖电泳并转移至硝基纤维素膜（Amersham, Hybond-C extra），42℃预杂交5 h，杂交18 h。探针为α-³²P-dATP标记的DuIFN-α片段，比活为6.5×10⁸cpm/μg DNA, 杂交液强度为6×10⁶cpm/ml。洗膜条件：第1次2×SSC/0.1%SDS, 2×40 min, 55℃; 第2次0.1×SC/0.1%SDS, 2×40 min, 55℃。采用KODAK X-Omat胶片，-80℃曝光5 h。

2结果

2．1DuIFN-α的RT-PCR检测我们采用不同浓度（0.1～10.0 μg/ml）PHA和不同浓度ConA（0.3～5.0 μg/ml）刺激鸭外周血单核细胞，用³H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖。发现5 μg/ml PHA刺激效果最佳（数据未发表），并且发现将抗原提呈细胞、T淋巴细胞进行初步分离后，再以一定比例混合进行刺激，效果优于PHA直接刺激未经分离的外周血单核细胞。加入一定比例的红细胞则有助于取得稳定的实验结果。为观察PHA刺激PBMCs后，是否诱导DuIFN-α的高水平表达，我们根据最近公布的DuIFN-α序列，设计相应引物，通过RT-PCR检测DuIFN-α的表达，发现与总mRNA类似，在PHA刺激4 h后，即可扩增出DuIFN-α特异性的PCR产物并持续至24 h（见图1，2）。该片段与阳性对照（以质粒616为模板）大小一致，完全符合预计值。在未经PHA刺激的PBMCs中则未检测到该片段，说明DuIFN-α在正常情况下关闭或呈低水平表达，其高水平表达不仅可由病毒诱导，而且也可由PHA诱导产生。

图1PHA刺激外周血单核细胞中RNA量的变化

Fig.1The effect of PHA stimulation on the total RNA amount in duck PBMCs

Note:M:PstI-Lambda DNA marker

2PHA刺激不同时间对DuIFN-α表达的影响

Fig.2The time-course of DuIFN-α expression post PHA stimulation

Note:+:positive control,using plasmid 616 as template；-:negative control,using H₂O as template；M：PstI-digested Lambda DNA marker