关键词: γδT细胞；结核杆菌低分子多肽抗原；神经酰胺；磁珠阳性分选

摘要目的：研究神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)诱导的γδT细胞活化及凋亡作用。方法：用结核杆菌低分子多肽抗原刺激正常人PBMC，并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδT细胞。通过MTT试验观察神经酰胺、鞘磷脂酶以及神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1对γδT细胞的活化作用；FACS检测其对γδT细胞的凋亡作用。结果：Mtb刺激获得的γδT细胞可达73%，磁珠分选后可高达98%；高浓度神经酰胺及鞘磷脂酶能抑制γδT细胞的增殖，而出现凋亡，Fumonisin B1则对γδT细胞的增殖及凋亡无明显影响。结论：鞘磷脂水解产生的神经酰胺对γδT细胞有致凋亡作用。

中国图书分类号R392.11

Role of ceramide in the activation and apoptosis of γδT cells induced by low molecular peptide antigen of Mycobacterium tuberculosis

AbstractObjective:To study the role of ceramide in the activation and apoptosis of γδT cells induced by low molecular peptide antigen of Mycobacterium tuberculosis.Methods:The low molecular peptide antigen dervied from Mycobacterium tuberculosis(Mtb) was applied to stimulate the peripheral blood mononuclear lymphoctyes of healthy donors.γδT lymphocytes coated by TCR γ/δ Hapten-antibody in combination with MACS anti-Hapten microbeads-FITC were separated with a LS⁺ positive selection MACS separator.γδT cells induced by ceramide,Sphingomyelinase and Fumonisin B1 were detected for their activation by MTT assays and for their apoptosis by flow cytometry.Results:The purity of the γδT lymphocytes stimulated by Mtb and sorted by MACS were up to 73% and 98% respectively. The high concentration of C2-Ceramide and sphingomyelinase were able to inhibit proliferation and to enhance apoptosis of γδT lymphocytes.Conclusion:Ceramide hydrolyzed from sphingomyeline can induced apoptosis of γδT cells.

Key wordsγδT lymphocytesLow molecular peptide antigen of Mycobacterium tuberculosisCeramide Magnetic positive selection

γδT细胞是不同于αβT细胞的另一类T细胞，具有抗感染、细胞毒及免疫调节作用^［1］。神经酰胺(Ceramide, Cer,又叫N-脂酰鞘氨醇)是鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)信号转导途径的第二信使分子，主要由鞘氨醇在神经酰胺合成酶(鞘氨醇-N-酰基转移酶)作用下酰基化形成或由SM在鞘磷脂酶(sphingomyelinase,SMase)作用下水解产生。Cer在调节细胞增殖、分化、细胞周期阻滞、细胞凋亡以及细胞衰老中的作用日益受到人们的重视^［2］。

本文用热处理的结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)低分子多肽抗原特异性扩增健康人外周血单个核细胞(PBMC)中的γδT细胞，观察外源性Cer、SMase及神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1对Mtb诱导的γδT细胞的活化及凋亡作用，以期探讨Cer对γδT细胞的活化和凋亡作用。

1材料与方法

1.1主要试剂和器材结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)是高温处理结核杆菌H37Ra株释放的10～14 kD的多肽，Henry Boom博士惠赠^［3-5］，淋巴细胞分离液系中国医学科学院血液学研究所产品；C2-Ceramide(N-acetyl-D-sphingosine,C2-Cer),SMase,Fumonisin B1及碘化丙锭(propidium iodide,PI)是Sigma产品；MTT是Fluka产品；鼠抗人荧光单抗CD3-PE，TCRγδ-PE，CD4-PE，CD-FITC，CD8-FITC，CD45-FITC购自Becton Dickinson或Dako公司；SDS，RNase及二甲基甲酰胺(N’，N-dimethylformamide,DEMD)系Amersco产品；MACS分离器，LS⁺分离柱及TCRγ/δ磁珠试剂盒购自Miltenyi Biotec公司(Germany)；流式细胞仪(flow cytometry)型号Coulter EPICS^R XL-MCL(安徽省立医院血液内科中心实验室)。

1.2TCRγδ细胞的获得抽取健康志愿者外周静脉血10～15 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液按常规法分离获取PBMC，用RPMI1640完全培养基，调整细胞浓度至1×10⁶～2×10⁶ ml^-1， 加入24孔培养板中，1 ml/孔，再加入Mtb 2.5 μg/ml，置于37℃，5% CO₂条件下培养，3～5 d后扩增，每隔3 d加入rhIL-2 50 U/ml，约10 d左右即可。

1.3磁珠阳性分选γδT细胞取3×10⁷个待选细胞，加入40 μl已抽气除菌的PBS缓冲液(含0.5% BSA，2 mmol/L EDTA)，10 μl TCRγ/δ抗体，12℃作用10 min；20 μl磁珠二抗12℃作用15 min；用上述PBS缓冲液洗涤，300 g，4℃离心；细胞重悬于PBS缓冲液中，装LS⁺柱，并置于磁板上，收集流出的细胞悬液为非γδT细胞，将LS⁺柱从磁板上取下，用PBS洗柱即为阳性分选物(γδT细胞)。

1.4细胞表型的鉴定用上述荧光单抗对待测的细胞进行染色^［3］，FCM检测，MinDMI Version 2.8软件分析。

1.5Cer等刺激γδT细胞活化作用将不同浓度的C2-Cer，SMase,Fumonisin B1作用于γδT细胞，在96孔板中培养，三复孔为一组，MTT法观察细胞增殖情况。

1.6Cer等对γδT细胞的凋亡作用将上述不同浓度C2-Cer,SMase及Fumonisin B1与已长期培养的γδT细胞共同培养于24孔板中37℃，5%CO₂作用24 h，PI染色，FCM检测，观察细胞凋亡情况。

1.7统计处理数据输入Microsoft excel进行统计分析。

2结果

2.1Mtb刺激PBMC 10 d左右γδT细胞可达73.89%，磁珠阳性分选后可达98.05%(图1)。

图1Mtb刺激及TCRγδ+免疫磁珠阳性分选结果

Fig.1The activation of Mtb and magnetic cell sorting on human peripheral γδT cells labeled with γδ MicroBeads-FITC using FCM analysis

图2C2-Ceramide对γδT细胞的致凋亡作用

Fig.2The apoptosis of γδT by C2-Ceramide

2.2C2-Cer、SMase、Fumonisin B1及Mtb诱导γδT细胞的增殖高浓度C2-Cer(1.0 mmol/L，250 μmol/L)及SMase(2 U)明显抑制γδT细胞的增殖；而Fumonisin B1则对γδT细胞的增殖无抑制作用。

2.3C2-Cer、SMase及Fumonisin B1对γδT细胞的凋亡实验中，经PI染色可见高浓度C2-Cer(1.0 mmol/L,250 μmol/L)及SMase(2 U，1 U)对γδT细胞有明显的致凋亡作用(图2)，1.0 mmol/L的C2-Cer可使γδT细胞的凋亡率高达83.74%，2 U/ml的SMase使γδT细胞的凋亡率达59.32%，而Fumonisin B1对γδT细胞的凋亡无增强作用。

3讨论

耐热性结核杆菌低分子多肽抗原是一种γδT细胞的强刺激剂^［5］，为获得研究所用的γδT细胞模型，本研究采用这种结核杆菌低分子多肽抗原来刺激健康志愿者的PBMC，γδT细胞亚群从4.33%扩增到73.83%，经免疫磁珠阳性分选后，γδT细胞可达98.05%，从而成功地建立了实验所需的γδT细胞模型系统。

本研究首次用免疫磁珠(TCRγδ⁺)阳性分选结核杆菌低分子多肽抗原活化的γδT细胞，获得了高纯度的γδT细胞，从而有利于对高纯度γδT细胞进行深入的研究，通过磁珠阳性分选细胞的收获率高，而且简便省时，整个分选过程约1 h，有利于无菌操作，以便继续培养γδT细胞；磁珠微小(直径50 nm)，分选后培养2 d FCM检测显示磁珠已从γδT细胞表面完全脱落下来，故磁珠阳性分选法较以往的洗淘法、阴性分选法及FACS分选法，具有既简便又对细胞损伤小的优点，值得作为获得高纯度γδT细胞的首选方法。

本研究应用人工合成的可渗透性C2-Cer、Cer合成酶抑制剂Fumonisin B1及SMase刺激结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδT细胞，见高浓度的C2-Cer及SMase可明显抑制活化的γδT细胞增殖，而Fumonisin B1对γδT细胞的增殖无明显影响，提示活化的γδT细胞在增殖中产生的Cer可能是SMase水解SM而产生，并非从头生物合成而来。

观察C2-Cer、SMase及Fumonisin B1对结核杆菌低分子多肽抗原化的γδT细胞的凋亡作用，见高浓度的C2-Cr及SMase刺激γδT细胞发生凋亡比对照组明显升高，并分别与抑制增殖的C2-Cer及SMase的浓度相对应，从两方面验证了高浓度C2-Cer及SMase促进γδT细胞的凋亡作用；Fumonisin B1对γδT细胞的凋亡无促进作用，再次证实通过SMase水解SM产生的Cer参与了γδT细胞的凋亡过程^［6］。

本课题受安徽省自然科学基金(99044542)和省教委科研基金(99j10154)资助

作者简介：宋秀宇，女，37岁，副教授，在<