关键词: γδT细胞；LAK细胞；细胞毒活性

摘要目的：通过体外分离、增殖培养获取γδT细胞、NK细胞和LAK细胞，并比较了3种细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法：收集用不同单抗分别包装被粘附的细胞，然后通过MACS细胞分选仪的分选，获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以单抗阻断效应的分析。结果：经MACS分离得到的γδT细胞，培养2 w后细胞数扩散600～800倍，CD3、CD8和γδ细胞表达阳性率分别是72.29%、58.02%和65.98%。γδT细胞对NK敏感细胞K562以及NK不敏感细胞Raji和XG-7这3种不同靶细胞均有较高的杀伤率，分别为35.98%、42.27%和69.08%；NK细胞对此3种细胞的杀伤率分别是45.12%、12.34%和29.27%；LAK细胞的杀伤率分别为44.01%、29.27%和25.68%。γδT细胞对经MHC-Ⅰ类单抗阻断前后的K562、Raji和XG-7 3种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论：γδT细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用；γδT细胞对MHC-Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化，提示γδT细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱。

中国图书分类号R392-33

Analysis comparatively the characteristics of γδT cell and LAK

MA An-LunGE Hai-LiangZHANG Dong-Qing

（Shanghai Institute of Immunology,Shanghai 200025）

AbstractObjective:As the function of γδT cells and NK in the immunological therapy is showing more and more important,the characteristics of γδ T cells,NK and LAK were analyzed comparatively after that they were richened by isolating and incubating in vitro.Methods:The cells were collected using MACS after the cells were panned respectively with special monoclonal antibodies.Then the characteristics including proliferation,phenotype,cytotoxin and the down regulation blocked by specific antibodies were analyzed.Results:The γδ T cells can expand 600～800 times after culturing 2 weeks and the percent of CD3,CD8 and γδ expressed on the collected cells were 72.29%,58.02% and 65.98% respectively γδ T cells showed the high cytotoxin to K562(NK sensitive cell line),Raji and XG-7 cell lines(NK non-sensitive cell lines).The percentage of cytotoxin reached 35.98%,52.27% and 69.08% respectively compared with γδT respectively.No obviously change of percent of γδT cytotxic ability to these target cells were observed using special MHC class I monoclonal antibody to block the γδT cell before coculturing the target cells with γδ T cells.Conclusion:All of γδ T cells,NK and LAK showed the non-specific cytotoxin to tumor cells.The cytotoxic capability of γδ T cells did not be effected after blocking with MHC class I monoclonal antibody.These results demonstrated that γδ T cell could kill more kinds of tumor cells than NK and LAK.

Key wordsγδ T cellsLAK cellsCytotoxin

肿瘤细胞的弱免疫原性是其得以逃逸机体免疫监视功能的重要原因之一。肿瘤细胞不表达或低表达MHC-Ⅰ类分子使得肿瘤特异性的MHC限制的CD4或CD8的αβT细胞难以激活而产生免疫效应来有效地清除肿瘤细胞。自1986年Saito等人首次报道了T细胞中的一个新亚型-γδT细胞以来，它对多种肿瘤细胞具有明显的识别与杀伤作用已被证实^［1］。多数认为γδT细胞对肿瘤细胞的识别过程不受MHC分子的限制^［2］。本文就体外分离和增殖培养得到的γδT细胞，NK细胞和LAK细胞，比较了3种细胞的抗肿瘤的生物学特性，以便于摸索一种在肿瘤过继性免疫治疗中更具有临床应用价值的治疗手段。

1材料与方法

1.1细胞株与主要试剂人红白血病细胞株K562，人淋巴瘤细胞株Raji，人Buritts淋巴瘤细胞株Daudi(美国ATCC)，人多发性骨髓瘤细胞株XG-7(苏州医学院张学光教授惠赠)。MACS单抗磁珠(基因公司)。抗γδ单抗、抗αβ单抗(B.D公司)。

1.2方法

1.2.1LAK细胞的培养正常人PBMC用500 U/ml rhIL-2的RPMI 1640营养液培养。

1.2.2γδT细胞的富集和培养将正常人PBMC置于预先经抗CD3单抗包被的培养板内，用500 U/ml的rhIL-2的RPMI 1640营养液培养5 d。收集细胞，用CD4、CD16、CD56单抗标记的磁珠作MACS细胞阴性分选，将分选得到的CD4^-、CD16^-、CD56^-细胞置于预先经抗γδ单抗包被的培养板内，同时加入经60 GY⁶⁰Co照射的Daudi和XG-7细胞(淋巴细胞∶肿瘤细胞为2∶1)，用500 U/ml的rhIL-2的RPMI 1640营养液培养。用免疫荧光法检测γδT细胞的百分率(65.98%±15.33%)。

1.2.3NK细胞的富集和培养将正常人PBMC置于预先经抗CD56单抗包被的板内，用500 U/ml的rhIL-2的RPMI 1640营养液培养5 d。然后收集细胞用CD16、CD56单抗标记的磁珠作MACS细胞阳性分选，得到CD16⁺、CD56⁺细胞经500 U/ml的rhIL-2的RPMI 1640营养液培养。用免疫荧光方法检测CD56⁺细胞的百分率(55.67%±11.29%)。

1.2.4免疫表型分析采用常规免疫荧光方法及流式细胞仪分析。

1.2.5体外细胞毒测定参照CytoTox96^TMNon-Radioactive Cytotxin Assay Kit(Promega)说明书，采用4 h-LDH释放测定法，并计算出杀伤活性^［3］。

1.2.6抗MHC-Ⅰ类单抗的阻断效应抗MHC-Ⅰ类单抗以及无关单抗分别与靶细胞作用4℃，30 min，然后按1.2.5方法检测γδT细胞对靶细胞杀伤活性。

2结果

2.1γδT细胞、NK细胞及LAK细胞的细胞增殖动力学用活细胞定量计数法观察γδT细胞，NK细胞及LAK细胞的细胞增殖效应。γδT细胞在培养2 w后达到高峰，细胞数扩增达600～800倍，5 w后增殖速度开始下降，7 w时细胞基本停止增殖。NK细胞在培养1 w时增殖速度不明显，到2 w后细胞内颗粒明显增多，细胞体积变小，逐渐趋于死亡。LAK细胞培养3 d后开始增殖，在3 w后达到高峰，以后增殖速度逐渐下降。

2.2γδT细胞、NK细胞及LAK细胞的表型分析经MACS分选得到的γδT细胞、NK细胞及LAK细胞用免疫荧光法检测其不同的细胞表型。从图1的数据看到γδT细胞、NK细胞及LAK细胞的CD3细胞百分率分别为72.29%、53.69%与80.81%。γδT细胞中的CD8细胞百分率高达58.02%高于其他3组(23.97%，46.32%和48.27%)。γδT细胞中的αβ细胞百分率为28.34%低于正常PBMC组(65.01%)和LAK组(78.84%)。其γδ细胞百分率高达65.98%，明显高于其他3组(6.62%，6.34%和21.01%，P＜0.01)。

2.3γδT细胞、NK细胞及LAK细胞的体外细胞毒效应分析用LDH酶释放法检测γδT细胞、NK细胞及LAK细胞对NK敏感的细胞K562以及NK不敏感的细胞Raji和XG-7的杀伤活性。γδT细胞对K562、Raji和XG-7 3种不同的靶细胞均有较高的杀伤率，分别为35.98%、52.27%和69.08%。尤其对NK不敏感的XG-7细胞的杀伤活性明高于其它组(P＜0.01)。

图1γδT细胞、NK细胞及LAK细胞的细胞表型

Fig.1Phenotype of γδ T cells,NK and LAK

图2γδT细胞、NK细胞及LAK细胞的体外细胞毒效应

Fig.2Cytotoxin of γδ T cells,NK and LAK

图3抗MHC-Ⅰ类单抗对γδT细胞的体外细胞毒效应的影响

Fig.3Effect of the cytotoin of γδ T cells by anti-MHC Ab

2.4抗MHC-Ⅰ类单抗对γδT细胞的体外细胞毒效应的影响结果如图3所示经抗MHC-Ⅰ类单抗封闭前后的K562、Raji和XG-7 3种不同的靶细胞，γδT细胞对它们的杀伤率无明显差异(P＞0.05)。

3讨论

过继性免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要手段之一。自1986年Rosenberg等首次证明荷瘤小鼠回输LAK细胞能延长小鼠存活期之后，以LAK、TIL细胞为代表的肿瘤生物治疗在临床上得到广泛应用，并取得了一定的疗效。1986年Saito首次发现在正常外周血淋巴细胞中有一群为数只占3%～10%的γδT细胞，它们表达CD3⁺、CD4^-和CD8^-。

我们建立的一种快速体外扩增人γδT细胞的方法是通过第一部分的抗CD3、抗γδ单抗的诱导增殖和Daudi、XG-7细胞的共同刺激以及第二部分的MACS分选来完成的。在细胞增殖方面，γδT细胞扩殖