关键词: 细胞因子；大脑神经细胞；c-fos；c-jun

摘要目的：探讨IL-6、IL-1β、TNFα在人胎大脑神经细胞体外发育过程中对原癌基因c-fos、c-jun的表达调控规律。方法：应用人胎大脑神经细胞无血清原代培养模型，通过DNA-RNA斑点杂交，采用计算机图像分析系统测定杂交点的平均灰度值。结果：c-fos、c-jun的表达均在IL-6、IL-1β、TNFα作用后15～30 min开始上调，1 h达高峰，而后下降。结论：这些细胞因子均在转录水平上促进神经细胞c-fos、c-jun的表达，为分析其生物学效应的分子机制奠定基础。

中国图书分类号R392R338

IL-6、IL-1β and TNFα induce the expression of c-fos and c-jun in human fetal cerebral neurons

PANG Zhi-LingLI Lan-YingWEI Jiao

（Institute of Endocrinology,TianJin Medical University,Tian Jin 300070）

AbstractObjective:To study the effects of IL-6、IL-1β and TNFα on the expression of c-fos and c-jun,which may provide the foundation for a further study in clinic.Methods:Used the a model of primary culture of human fetal cerebral neurons in serum-free medium,by DNA-RNA dot blot hybrdization.Results:The expression of c-fos and c-jun was increased between 15 min to 30 min after stimulation,reached a maximum at 1 h and declined over the subsequent 1 h.Conclusion:IL-6、IL-1β and TNF α have induce the expression of c-fos and c-jun during development of human fetal cerebral neurons in vitro at the level of transcription.

Key wordsCytokineCerebral Neuronc-fosc-jun

中枢神经系统（CNS）中细胞因子参与神经细胞发育、分化、信号传递、基因表达等几乎所有的神经活动过程。正常生理脑发育过程及神经系统疾病情况下IL-6、IL-1β、TNFα等细胞因子作用的研究资料不断出现。c-fos、c-jun原癌基因为编码核蛋白的基因，是快速反应性基因中研究最多最深入的一种，其在CNS表达的文献报道近百余篇^［1-3］。然而有关人胎大脑神经细胞c-fos、c-jun的表达规律未见系统报道。本文拟利用早期人胎大脑神经细胞无血清原代培养模型为实验体系，采用DNA-RNA斑点杂交的方法对在IL-6、IL-1β、TNFα作用下的c-fos、c-jun体外表达规律加以探讨，为阐明这3种细胞因子对神经细胞作用的分子机制提供实验依据。

1材料与方法

1.1细胞培养取双亲健康的妊娠10～13 w人工流产胎儿的双侧大脑半球，依照我室无血清液原代大脑神经细胞培养的方法^［4］，接种细胞浓度为1×10⁶ ml^-1，培养液中加10%胎牛血清，48 h后换无血清培养液，继续培养48 h后分组实验。对照组仅

为无血清培养液。实验组分为IL-6（100 U/ml）组、TNFα（100 U/ml）组（邦定公司），IL-1β（10 U/ml）组（BOEHRINGER MANNHEIMCO.）。自加入因素起开始计时t=0，并继续培养，而后分别于培养15 min、30 min、1 h、2 h、4 h，离心收集细胞。

1.2DNA-RNA斑点杂交测定细胞原癌基因c-fos、 c-jun的表达调控c-fos、c-jun质粒由医科院基础所提供。采用氯化钙法进行扩增；碱裂解法提取纯化质粒DNA，经非放射性DNA标记检测试剂盒（BOEHRINGER MANNHEIMCO.），按其说明程序进行DNA标记。用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取样品细胞的总RNA^［5］。每个实验点取30 μg细胞RNA，以含目的基因片段的质粒DNA作为阳性对 照；以鲑鱼精子DNA为阴性对照点膜备用。 按上述试剂盒说明42℃预杂交6 h。相同条件 下杂交16 h，探针浓度为100 ng/ml，洗膜、显色 、终止反应、进行拍片。采用MIAS- 2000型计 算机图像分析系统测定杂交斑点的平均灰度值，采用方差分析进行统计学处理。

2结果

在IL-6、IL-1β、TNFα作用下，体外培养的人胎大脑神经细胞c-fos、c-jun原癌基因的表达均出现上调现象，并呈较好的一致性。上调时间始于15或30 min，上调高峰时间3种因素均在作用后1 h。而其上调幅度不一，c-fos的表达水平为IL-1β（为对照组的129.35%，P＜0.01） ＞IL-6（112.5%，P＜0.01） ＞TNFα（103.84%）；而对c-jun表达为TNFα（157.9%） ＞ IL-6(124.68%,P＜0.01) ＞ IL-1β（112.5%）。3种因子作用于上调高峰后，表达均呈下降趋势，于4 h c-fos表达除IL-6降至106.78%外，IL-1β、TNFα均降至基础表达水平；而c-jun表达均尚未达到基础水平，分别为112.99%，106.70%，106.40%（见图1、2）。

图1IL-6、IL-1β和TNFα对人胎大脑神经细胞c-fos表达的影响

Fig.1Effects of IL-6、IL-1β and TNFα on the expression of c-fos in human fetal cerebral neurons

图2IL-6、IL-1β和TNFα对人胎大脑神经细胞c-jun表达的影响

Fig.2Effects of IL-6、IL-1β and TNFα on the expression of c-jun in human fetal cerebral neurons

3讨论

近年来研究表明原癌基因及其蛋白产物在生命活动中具有极其重要的作用。原癌基因种类很多，涉及细胞信号传导系统的各个层次：包括细胞外信号如生长因子、受体（如生长因子受体）、膜G蛋白、膜及胞质蛋白磷酸化及核内核蛋白等。编码核内蛋白的原癌基因主要有fos、jun、myc等。业已证明，存在于正常细胞内的c-fos原癌基因所编码的fos蛋白在神经系统的信号传导中起重要作用，它被认为是一种第三信使调控靶基因的表达^［6］，使短时程刺激变为对神经系统的长时程效应，参与神经细胞生长、分化等重要生命活动，是细胞内重要信使。c-fos、c-jun被认为是细胞内快速反应基因（IEG），偶联细胞外信息与细胞内靶基因的转录，在正常情况下，中枢神经系统某些部位的神经细胞可有c-fos、c-jun基础水平的表达，但水平较低，不容易检测到；然而神经细胞可被多种不同的生理和病理性刺激诱导，发生c-fos、c-jun快速、短暂、高水平的表达^{［3，6，7］}。

在正常脑发育过程中IL-6、IL-1、TNF等多种细胞因子的表达呈显著的时空性，共同参与调节脑发育的过程。本文研究结果表明，IL-6、IL-1β、TNFα对体外培养的人胎大脑神经细胞c-fos、c-jun原癌基因表达的调控均存在一定的时程特异性：加入刺激因子后15～30 min开始出现表达上调，1 h达高峰，而后逐步下降。提示细胞因子（IL-6、IL-1β、TNFα）通过应答效应激活IEG的转录，进而发挥其生物学效应，参与细胞生长、分化、信息传递等过程，而病理情况下其表达及调控与多种疾病的发生发展有关。

关于c-fos、c-jun等表达的调节机制，至今不十分清楚。研究证实至少有3种明确的第二信使能激活c-fos，即甘油二酯（DG）依赖的蛋白激酶C（PKC）、cAMP和钙调蛋白复合物(Ca2⁺-CaM)。细胞因子，激素等刺激物作为第一信使作用于胞膜上的受体，激活膜内第二信使，后者再转而激活 IEG的转录，该转录生成的mRNA逸出胞核到胞浆，翻译成fos、jun等核磷蛋白，二者结合形成异源二聚体，激活蛋白-1（AP-1），重新转位至核内，结合到靶基因的DNA调节区，进而调节靶基因表达和转录速率，发挥信使作用。

天津市科委自然科学基金资助项目(963108411)

作者简介：庞智玲，女，教授，主要研究方向为激素与脑发育及代谢性骨病

参考文献

1，Sehobitz B, Kloet E R O, Holsboer F. Gene expression and function of interleukin 1, interleukin 6 and tumor necrosis factor in the brain. Progress in Neurobiology, 1994;144(5):397

2，Heaney M, Golde D W. Soluble cytokine receptor. Blood,1996;87 (3)847

3，Hara B F, Watson F L, Andretic R et al. Daily vartion of CNS gene expresion in nactural vs. diurnal rodents and in the developing rat brain. Molecular Brain Research，1997;48:73

4，庞智玲，张文治，李兰英.人胚大脑神经细胞在无血清培养液中的生长特性.细胞生物学杂志，1987；9（4）：176

5，Chomczynski P, Sacchi N.Single-step method of isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extration. Analytical Biochemistry，1987;162:156

6，Gilby K L, Armstrong J N, Curre R W et al. The effects of hypoxia-ischemia on expression of c-fos, c-jun and Hsp70 in the young rat hippocampus. Molecular Brain Research，1997;48:87

7，Oliveira C L D, Guimaraes F S, Bel E A D. c-jun mRNA expressi