关键词: IL-12；基因转染；树突状细胞；肿瘤疫苗；Th1/Th2分化

摘要目的：探讨IL-12基因转染的树突状细胞（DCs）能否体外加强细胞免疫反应。方法：脂质体转染（经过Flt-3L、SCF、GM-CSF刺激）增殖周期中的DCs前体细胞。加入GM-CSF、IL-4和TNF-α扩增转染细胞。在流式细胞仪上分析细胞表型及IL-12的表达。成熟DCs装载上分别能与HLA-I 类 和HLA-II类分子结合的多肽，观察IL-12基因转染DCs对特异性Th细胞发育及特异性CTL诱导和功能的影响。结果：IL-12基因转染细胞在上述细胞因子作用下发育成为能有效表达IL-12并具有典型形态学与表型特征的DCs。在装载上CD4⁺T细胞表位HBcAg_50-69后，能诱导这些细胞发育成为IFN-γ产生型的Th1细胞。HLA-A201亚型DCs在其同时装载CD4⁺T和CD8⁺T细胞相应的表位后，IL-12 基因转染DCs所诱导产生的自身淋巴细胞的CTL效应增强。结论：IL-12基因转染的DCs能增强对Th1细胞的刺激和CTL效应的诱导能力，提示它在肿瘤疫苗发展中的潜力。

中国图书分类号R398

IL-12 engineered human dendritic cells in enhancing antigen presenting functions to augment cell mediated immune response in vitro

QU Chun-FengGU Pei-DiJU Ji-Yu

（National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Chinese Academy Medical Sciences,Beijing 100021）

AbstractObjective:To explore whether IL-12 engineered human dendritic cells (DCs) might enhance its antigen presenting functions to augment cell mediated immune responses. Methods: The early replicating progenitors of DCs (stimulated by Flt-3L, SCF and GM-CSF) were transfected with IL-12 recombinant retroviral vector by lipofection. The transfected cells were driven through committed expansion into DCs lineage by adding the above cytokines plus IL-4 and TNF-α. IL-12 transfected and untransfected DCs pulsed with HBcAg_50-69 and p53_264-272 were used to induce specific Th and CTL immune responses in vitro. Results: After culturing in the cocktail of the above mentioned cytokines, IL-12 transfected DCs developed and maintained the characteristic morphological and phenotypic features of DCs. When the DCs were pulsed with a broad spectrum class II epitope HBcAg_50-69, the IL-12 transfected DCs stimulated the autologous lymphocytes to proliferate to a higher level, and the primed Th cells released more IFN-γ when compared with the effects shown in untransfected DCs. Meanwhile, the production of IL-4 was decreased. Preliminary experiment in HLA-A201 subtype system showed that the autologous lymphocytes, primed by IL-12 transfected DCs loaded with class I and class II restricted epitopes, secreted more IFN-γ when they were subsequently co-cultured with A201 target cells loaded only with class I restricted peptide. The latter fact indicated that the specific CTL response was enhanced. Conclusion: IL-12 engineered human dendritic cells enhanced its functions to stimulate Th1 cells as well as to induce specific CTL effect, showing its promise for developing cancer vaccine.

Key wordsIL-12Dendritic cellsGene transfectionCancer vaccineTh1/Th2 differentiation

IL-12通过增强特异性与非特异性细胞免疫应答，而成为一种有效的抗肿瘤、抗感染免疫的生物佐剂^［1］，但其全身应用毒性严重。因此，寻找合适的应用途径具有重要的临床意义。我们以前对p53蛋白的一些多肽抗原表位研究显示：p53_264-272多肽是HLA-A201个体CD8⁺T细胞识别表位^［2］。HBcAg_50-69多肽是一段能够较广泛地被CD4⁺T淋巴细胞所识别的HBV核心抗原表位^［3］。本文报道采用这两种多肽抗原表位观察了IL-12基因转染的DCs在呈递抗原多肽后对特异性Th细胞的增殖与分化、以及对特异性CTL的诱导是否有增强的效应，籍以探讨其在肿瘤疫苗发展中的应用潜力。

1材料与方法

1.1 载体与细胞人IL-2逆转录病毒双亚基共表达载体pL35P40SN是在pLXPXSN载体（由NIH的Dr. R. Morgen 赠送）基础上构建^［4］。174CEM T2细胞株由美国NCI的Dr. E. Appella赠送。

1.2抗原性多肽p53_264-272为HLA-201 分子限制的CD8⁺T细胞识别表位。氨基酸序列为LLGRNSFEV, 由 Dr. E. Appella 赠送，HBcAg_50-69为HLA-II类分子限制的CD4⁺T细胞识别的较广谱的抗原表位，氨基酸序列为PHHTALRQAILCWGELMTLA，由青岛大学医学院分子病毒学实验室合成。

1.3主要试剂细胞因子SCF、GM-CSF、Flt-3L、IL-4，IL-12定量ELISA检测试剂均为R&D产品，TNF-α为北方同正公司产品，IL-4和IFN-γ检测试剂为晶美公司进口分装试剂, DOTAP 为B.M. 产品。

1.4 PCR-SSP进行HLA-A2型及A201亚型分析方法参见文献［2，5］，所用引物购自英国Bristol大学移植科学部。

1.5人脐带血DCs的培养及IL-12基因转染 25 ng/ml SCF溶于0.1 mol/L pH8.5 Na₂HPO₄中，每孔0.8 ml加入到6孔细胞培养板中，4℃过夜。经淋巴细胞分离液分离的新生儿脐带血（产后12 h内）单个核细胞加入到上述细胞培养板中，37℃孵育1～2 h，用预温到37℃的培养液进行洗涤。粘壁细胞加入Flt-3L、GM-CSF、SCF刺激48～50 h，进行DOTAP脂质体介导的基因转染，DOTAP与DNA之比为4：1，转染过程中继续加入上述细胞因子，转染共进行8～8.5 h。此后于培养的第5、第8天再转染两次，每次2～3 h。转染终止后加入含细胞因子的培养液继续培养。第8天后加入IL-4和TNF-α，12～14 d收集细胞进行其表型鉴定及细胞因子的表达检测及功能分析。

1.6培养细胞表型分析收集培养12～14 d的细胞，进行CD3、CD14、CD19、CD80、CD86、MHC-I、MHC-II的间接免疫荧光染色（所用试剂均为DAKO产品），在Coulter流式细胞仪上进行检测。

1.7肽特异性淋巴细胞增殖实验12～14 d常规培养成熟的DCs、重组人IL-12基因载体及空载体pLXPXSN转染的DCs，经洗涤后悬浮于AIM-V培养液中（1×10⁶ ml^-1），每孔0.2 ml加到24孔板中。然后加入HBcAg_50-69多肽使其终浓度达到10 μg/ml，混匀后放置于37℃ 2 h。加入液氮冻存复苏后的自身淋巴细胞0.5 ml，使刺激细胞与应答细胞数之比为1：10。放置于37℃培养，24 h后加入IL-2（10 U/ml）。第7天按上述方法重复刺激1次。收集培养细胞上清进行IFN-γ、IL-4的检测（按厂家说明进行）。将上述增殖细胞分3份均匀加入到96孔培养板中，随后加入³H-TdR继续培养16～18 h，收获细胞进行β计数。采用刺激指数（Stimulating Index, SI）进行分析：

1.8多肽特异性CTL的体外诱导及其活性的检测参照文献［2，5］对所收集到的脐带血通过PCR-SSP法筛选HLA-A201亚型个体，其DCs前体细胞按照前述方法进行IL-12基因转染及DCs的扩增培养。部分培养DCs于第7天加入TNF-α诱导24 h促进其成熟。将细胞洗涤后悬浮于AIM-V中，置于24孔板中加入HBcAg_50-69及p53_264-272 两种多肽，终浓度均分别为10 μg/ml。余同上。通过此方法诱导的细胞作为效应细胞。174CEM T2细胞按前述方法进行p53_264-272多肽的结合，多肽浓度为50 μg/ml，洗涤后作为CTL的靶细胞。两者共同培养，收集培养48 h的上清检测其IFN-γ（按厂家说明进行）的分泌能力。

2结果

2.1人脐带血造血干细胞的富集在CD34阳性的造血干细胞的表面通常也存在着一种酪氨酸激酶受体——c-kit， 其配体为干细胞因子（Stem Cells Factor，SCF）^［6］。本实验采用预包被于细胞培养板上的SCF来富集人脐带血中的c-kit阳性造血干细胞，在光镜下观察发现，富集得到的造血干细胞较牢固地粘附于细胞培养板上。采用FITC标记的CD34抗体进行直接免疫荧光染色，流式细胞仪测定分析显示，通过上述方法所富集到的细胞，其CD34阳性率约80%。

2.2IL-12基因表达载体转染DCs前体细胞后DC的发育和IL-12的表达通过形态学观察和流式细胞仪分析，发现IL-12基因转染的DCs在培养12～14 d后，发育为具有典型形态学及表型特征的DCs细胞，细胞表面有大量的CD80、CD86、HLA-I、HLA-II分子表达。通过细胞内细胞因子染色法检查发现，IL-12在转染细胞中的表达可达到50%，每10⁶细胞中IL-12的产量为1.2～1.8 ng/24 h。

2.3IL-12基因转染的DCs对Th细胞增殖和分化的影响IL-12基因转染DCs对CD4⁺T淋巴细胞增殖水平的影响结果如图1所示。为确定上述对HBcAg