关键词: Fas；细胞因子；凋亡；IDDM

摘要目的：研究人β胰岛细胞Fas的表达及细胞因子诱导Fas表达量的增加在β胰岛细胞杀伤中的作用。方法：用FACS检测IFN-γ和TNF-α作用于人β胰岛细胞株（NIT）前后Fas表达水平及sFasL和抗Fas介导细胞凋亡的变化。结果：NIT表面无Fas表达，IFN-γ和TNF-α可促进其Fas表达增加，以及对sFasL和anti-Fas介导细胞毒敏感性增加。结论：细胞因子诱导β胰岛细胞表面Fas的表达可能在I型糖尿病(IDDM)的病理损伤中起重要作用。

中国图书分类号R392.11

Human β-cells destruction correlates with Fas expression on β-cells induced by IFN-γ and TNF-α

ZHOU Hua-RongLI MingZHANG Yue

（Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030）

AbstractObjective:To study the effect of increased expression of Fas on the killing of β-cells .Methods:The level of Fas expression and apoptosis of human β-cells strain (NIT) were detected by FACS.Results:There is no Fas expression on NIT. But Fas expression can detected by culturing NIT with IFN-γ and/or TNF-α.The apoptosis of NIT induced by sFasL and anti-Fas correlates with the level of Fas expression.Conclusion:Fas expression induced by cytokine may represent a factor for the initiation of β-cells destruction.

Key wordsFasCytokineApoptosisIDDM

Fas/FasL介导的细胞凋亡在免疫系统的发育，免疫防御和自身免疫病中均占有重要地位。最近的研究表明，糖尿病β胰岛细胞是通过Fas/FasL途径杀伤的。动物实验证明Fas/FasL的相互作用在非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠I 型糖尿病(IDDM)的自然病程中起关键作用^［1，2］。 人类I型糖尿病和NOD小鼠的胰腺炎和糖尿病的发生有许多相似的地方^［3］。为了深入探讨Fas在人类β胰岛细胞杀伤中的作用，本文利用人类β胰岛细胞株(NIT)来研究改变NIT的Fas 表达后,sFasL和anti-Fas 对NIT杀伤的改变，从而为研究人类IDDM的发生发展提供实验依据，也为今后进一步探讨移植免疫打下基础。

1材料与方法

1.1主要试剂Fas Ab和 Fas-L（中山生物技术有限公司）, IFN-γ和TNF-α（美国GENENTEC公司）,嘌呤霉素（SIGMAL公司）。

1.2FACS 检测IFN-γ和TNF-α诱导前后NIT表面Fas表达

1.2.1 NIT细胞Fas 表达NIT细胞由澳大利亚WEHI实验室惠赠，我室传代保种。取NIT细胞1×10⁶个，加入稀释后Fas 抗体10 μl，4℃4 h，PBS洗3次，加入稀释后荧光抗体10 μl，4℃避光45 min，PBS洗3次，离心后加PBS 100 μl, 悬起细胞,上机检查。

1.2.2IFN-γ和TNF-α与NIT作用后Fas 表达NIT细胞常规培养上清中，分别加入TNF-α(1 000 U/ml）、IFN-γ（1 000 U/ml）以及TNF-α(1 000 U/ml）+IFN-γ(1 000 U/ml），5%CO₂，37℃培养72 h，FACS 检测同上。

1.3FACS检测sFasL和anti-Fas对IFN-γ和TNF-α诱导前后NIT的杀伤

1.3.1不同浓度sFasL对NIT的杀伤取NIT细胞5×10⁶个,分别加入48孔板内，每孔1×10⁶个。培养上清中分别加入1640和1、10、20、40 ng/ml的sFasL, 常规培养24 h后，-20℃、70%乙醇固定4 h。1 000 r/min离心5 min,10 ml PBS洗1次后，将细胞重悬于0.5 ml PBS，加入1 ml抽提缓冲液(96 ml 0.2 mol/L Na₂HPO₄ + 4 ml 0.1 mol/L枸橼酸混合液 pH7.8)混匀。室温静置5 min，离心弃上清。重悬于1 ml DNA染液(200 μg PI溶于10 ml PBS+ 2 mg无DNA酶活性的RNA酶）。室温避光染色30 min，用FACS检测。

1.3.2不同浓度anti-Fas对NIT的杀伤细胞处理同前，常规培养上清中分别加入1640和5、50、500 ng/ml的anti-Fas,作用24 h后, 凋亡检测前细胞处理同1.3.1, 用FACS检测。

1.3.3sFasL对细胞因子作用后NIT的杀伤取NIT细胞4×10⁵个,加入48孔板4孔内,每孔1×10⁵个，常规培养上清中分别加入1640、TNF-α(1 000 U/ml）、IFN-γ（1 000 U/ml）以及TNF-α(1 000 U/ml）+IFN-γ(1 000 U/ml）,5%CO₂，37℃培养72 h后，每孔加入10 ng/ml sFasL, 继续培养24 h, 凋亡检测前细胞处理同1.3.1，FACS检测。

1.3.4anti-Fas 对细胞因子作用后NIT的杀伤 用细胞因子处理NIT细胞同1.3.3，每孔均加入anti-Fas 5 ng/ml作用24 h后, 凋亡检测前细胞处理同1.3.1,FACS 检测。

2结果

2.1FACS 检测IFN-γ和TNF-α诱导前后NIT表面Fas的表达

2.1.1NIT细胞Fas的表达 以Fas高表达细胞株Jurkat为阳性对照，FACS检测NIT细胞表面无Fas表达，见图1。

2.1.2IFN-γ和/或TNF-α与NIT作用后Fas的表达IFN-γ和/或TNF-α作用后均可引起NIT表面Fas表达的增加，统计学分析均有显著性差异。其中TNF-α对Fas表达上调作用大于IFN-γ,而二者协同则作用更明显，见图2。

2.2sFasL和anti-Fas对IFN-γ和TNF-α诱导前后NIT的杀伤

2.2.1不同浓度sFasL和anti-Fas对NIT的杀伤用不同浓度sFasL和anti-Fas作用于NIT引起的细胞凋亡与细胞的自然凋亡在统计分析上无意义，进一步证明NIT表面无Fas表达，见图3。

图1FACS 检测NIT表面Fas表达

Fig.1Screen of Fas expression by FACS assay

Note:no Fas expression on NIT(left), high Fas expression cell strain Jurkat as positive control (right)

图2细胞因子作用后NIT 表面Fas的表达

Fig.2Fas expression after cultured with different cytokines

Note:values are means ±SE for four separate experiments.*P＜0.05，**P＜0.01，0 means without cytokines

图3不同浓度sFasL和anti-Fas对NIT的杀伤

Fig.3Apoptosis of NIT induced by different concentration of sFasL and anti-Fas

2.2.2sFasL和anti-Fas对细胞因子作用后NIT的杀伤IFN-γ和TNF-α与NIT细胞共同作用后, 诱导细胞表面Fas表达增加。加入sFasL后引起细胞凋亡明显增加,且细胞凋亡数与Fas表达成明显正相关。anti-Fas引起细胞凋亡情况与sFasL类似（资料未显示），见图4。

图4sFasL对细胞因子作用后NIT的杀伤

Fig.4Apoptosis of NIT induced by sFasL after treated with cytokines

3讨论

目前人们普遍认为I 型糖尿病是一种自身免疫性疾病，疾病病程分为2个阶段，第1阶段主要表现为淋巴细胞的浸润，第2阶段为大量β胰岛细胞死亡，出现高血糖^［4］。但是什么因素导致β胰岛细胞的破坏，一直未弄清楚。最近，在NOD小鼠上作出的一系列试验证明，Fas/FasL相互作用是一个可能的机制。Chervonsky利用NOD小鼠和Fas基因缺陷的lpr小鼠杂交，得到NOD^Ipr/Ipr小鼠。这种小鼠虽有淋巴细胞浸润，但并不发展成为糖尿病, 提示IDDM中的第1个阶段向第2个阶段的发展是可以阻断的, Fas表达在此病程进展中有重要作用^［5］。为研究Fas表达在人IDDM病程中的作用，我们利用人β胰岛细胞株NIT进行体外试验，发现正常情况下，NIT表面无Fas表达，对sFasL和anti-Fas诱导的凋亡不敏感。在IFN-γ和TNF-α作用下，Fas 表达增加，同时对sFasL和anti-Fas 引起的凋亡也变得敏感。这给我们一个提示，是否因为遗传或其它因素导致淋巴细胞浸润，局部分泌的IFN-γ和TNF-α导致Fas表达增加, β胰岛细胞破坏。当然Fas/FasL相互作用不可能是唯一破坏β胰岛细胞的机制，因为即使用细胞因子充分诱导NIT 表面Fas表达后, 也只有30%的β胰岛细胞杀伤，但很可能Fas/FasL的相互作用是一个很重要的产生其他杀伤机制的因素。

国家自然科学基金资助项目(NO.39870712)

作者简介：周华蓉，女，25岁，博士，主要从事移植免疫研究；沈关心，男，45岁，博士生导师，主要从事肿瘤免疫和移植免疫研究

参考文献