关键词: B7-1；协同刺激分子；单克隆抗体；恶性淋巴瘤

摘要目的：制备鼠抗人B7-1分子的功能性单克隆抗体，研究其对 高表达相应配基分子细胞的生物学效应。方法：用两株转人B7-1基因细胞株XG7-B7和L-B7分别作为免疫原及 检测细胞株，利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。以快速定性试纸分析法鉴定单抗 所属的小鼠IgG亚类，采用竞争抑制及间接免疫荧光法分析单抗的特异性和亲和力，以高表 达B7-1分子的恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi为靶细胞，分析单抗对其生长的影响。以人多发 性骨髓瘤细胞转入B7-1基因细胞株XG1-B7为刺激细胞，以人外周血单个核细胞(PBLs)为反 应细胞，用MTT法分析单抗的中和活性。结果：成功地获得了1株鼠抗人B7-1的功能性单克隆抗体(克隆4E5) ， 属于小鼠IgG1亚类，经流式细胞仪分析，4E5与PBLs、体外人工诱导的树突状细胞(DCs)、Ra ji和Daudi的阳性结合率分别为10.2%、95.1%、92.7%及89.2%；能完全阻断标准抗人B7 -1单抗与相应抗原的结合。同时还发现，单抗4E5能显著地抑制恶性淋巴瘤细胞Raji和Daud i的生长繁殖，并能阻断B7分子介导的协同刺激信号的传导。结论：单克隆抗体4E5是一株抗人B7-1分子的功能性单抗，具有重要的 研究和应用价值。

中国图书分类号R392.11

Preparation of functional monoclonal antibody against h uman CD80(B7-1) and analysis of its biological effects

QIU Yu-Hua,JI Yu-Hong,GUO Ling et al.

(Institute for Immunology ,Suzhou Medical College,Suzhou 215007)

AbstractObjective:To obtain a monoclonal antibody(mAb) a g ainst human CD80(B7-1) and to study of its biological effects.Method s:The hybridoma cell line was obtained by using the B lymphoma hybrid oma technique after immun ization of Balb/c mice with XG7-B7 the cells.Ascites were induced to produce th e mAb.The specificity and affinity of mAb were verified B7 competition and FACS. Expression of B7-1 in PBLs,DCs,Raji and Daudi were studied by indirect immunofl uorescence.Using counting and trypan blue staining,inhibitory effects of mAb on R aji and Daudi cells were analyzed.The neutralization activity of the 4E 5 determined by MTT assay using PBLs as response cells.Results:The anti-CD80(B7-1) was obtained.The expression of B7-1 in PBLs、DC、Raji ad Daudi was 10.2%，95.1%，96.7% and 89.2%,respec tived 4E5 can inhibit the growth in Raji and Daudi cells and block the costimula tory signals of B7/CD28.Conclusion:4E5 is a specific and functional anti-CD80(B7 -1) and has high affinity for its ligand.It may be of significant value in basi c studies and find clinical applications.

Key wordsCD80(B7-1)Costimulatory moleculeMonoclon al antibodyMalignant lymphoma

B7是激发有效的细胞免疫反应所必需的协同刺激分子。B7家族包括3个成员 ，即B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。其中对B7-1的研究最多，该分子为约50 kD的跨 膜 糖蛋白，基因定位于3q21，属免疫球蛋白超家族(IGSF)的成员之一。B7与CD28/CTLA-4的结 合对免疫应答起着重要的调节作用^［1，2］。一般认为CD28作为协同刺激分子的受体 ，通过与APC上B7分子的结合，起着传递信号、增强或放大免疫反应的作用，而CTLA-4在调 控T细胞反应的起始和终止方面起重要作用。正常生理状态 下，B7家族的 成员在功能上既分 工又合作，协调地控制着免疫应 答的进行。而在一些病理状态下，这种协调性可发生改变^［3］。最近的研究表明，B7家族协同刺激分子及其受体的异常表达在某些疾病尤其 是自身免疫性及过敏性疾病的发生、发展中起一定作用^［4］。本文报道一株鼠抗人B 7-1功能性单克隆抗体的制备及其生物学特性，尤其是对恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi的生 长抑制作用及对B7分子介导的协同刺激信号阻断作用的初步研究结果。

1材料与方法

1.1主要试剂1640和DMEM培养基(Gibco美国)，HAT、HT选择培养基(Si g ma美国)，PEG(Boehringe德国)，G418(Gibco美国)，标准抗人B7-1单克隆抗体(Immunotech 法国)，Protein G(Pharmacia瑞典)，小鼠IgG亚类快速定性试纸(Argen法国)。

1.2细胞株及培养方法XG7-B7和XG1-B7为人多发性骨髓瘤细胞转人B7 -1基因细胞株(本室建立)，XG1为人多发性骨髓瘤细胞(本室建立)，L-B7为小鼠成纤维细 胞转人B7-1基因细胞株(本室建立)，Raji和Daudi为人恶性淋巴瘤细胞株(ATCC美国)。这 些细胞株均 采用含10%FCS的1640培养基培养，其中转基因细胞的培养基中添加抗性筛选药物G418，以保 持目的基因产物的稳定表达。

1.3分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤建株将生长良好的XG7-B7细胞注 入小鼠的背部皮下及腹腔(1×10⁷/只)。间隔3 w重复免疫，第2次免疫后10 d左右眼框取 血测定血清效价。于加强免疫后3～4 d取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(5∶1)，以5 0% 的PEG溶液(分子量1 500)为融合剂进行杂交，用含1%HAT、20%FCS的DMEM培养。以L-B7为检 测细胞株，用间接免疫荧光法对杂交瘤细胞的培养上清进行筛选，阳性孔细胞用有限稀释法 进行单克隆化培养，直至抗体分泌阳性率为100%。选择生长良好的杂交瘤细胞克隆(4E5)扩 大培养并及时液氮冻存。

1.44E5的生产及纯化腹水型单抗的生产按本室建立的方法进行^{［ 5］}，单抗的纯化采用Protein G亲和层析法：将腹水加入CaCl₂、Sulfate dextran溶液 ，搅拌后静置0.5 h，离心(12 000 r/min，20 min)去除纤维蛋白。上Protein G亲和层析 柱， 甘氨酸洗脱，收集蛋白峰流出液，及时用pH 8.0的Tris溶液矫正pH至7.0，对PBS透析后 用 751紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量，其浓度的计算公式为：抗体蛋白(mg/ml)=OD ₂₈₀×1.55-OD₂₆₀×0.76。

1.54E5的亚类鉴定将快速定性试纸条轻轻插入含有约0.2 ml杂交瘤细 胞培养上清的小塑料管中，几分钟后试纸上出现与某一亚类名称相对应的蛋白条带， 此即该抗体所属的小鼠IgG亚类。

1.64E5的效价鉴定以XG7-B7为检测细胞，将杂交瘤细胞的培养上清、 腹水和纯化后的抗体蛋白梯度稀释后与之结合。用间接免疫荧光法分析，以出现同样阳性率 及荧光强度时的最大稀释倍数为抗体的效价。

1.74E5的特异性鉴定采用竞争抑制分析法，将XG7-B7细胞(5×10⁵/ 管)，用PBS洗涤后加入4E5抗体(每管10 μg/50 μl)，4℃作用45 min，洗涤后加入标准 C D80-PE直标单抗(每管2 μg/50 μl)，作用后用流式细胞仪分析。同时设置阴、阳性对 照。

1.84E5对DCs的识别收集按本室方法^［6］诱导的DCs(5×10⁵/ 管)，加入4E5单抗与之结合，洗涤后加入羊抗鼠荧光二抗。用流式分析仪分析。

1.94E5对PBLs、Raji和Daudi的识别将人PBLs单独及分别与Raji和Daud i细胞1∶1混合后分于小试管中(5×10⁵/管)，加入4E5单抗及羊抗鼠荧光二抗，用流式细 胞仪分析。

1.104E5对恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi的生长抑制作用将Raji(1×10⁵ ml^-1)和Daudi(2×10⁵ ml^-1)培养于24孔板中，加入4E5单克隆抗 体，使其终浓度分 别为1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 μg/ml。在培养的24、 48、72、96 h时间点，分别计数细胞浓度。

1.114E5的中和活性分析将丝裂霉素处理后的XG1-B7细胞(1×10⁵ ml^-1)与人PBLs(1×10⁶ ml^-1)等体积(各100 μl)混合于96孔板中，加入4E 5单抗，使其 终浓度为20 μg/ml，培养72 h，每孔加入20 μl 5%MTT溶液，继续培养4～6 h，测定OD 570，同时设置无关单抗及刺激细胞的对照实验组。

2结果

2.1特异分泌抗人B7-1单克隆抗体的杂交瘤建株先后共融合12块96孔 板 ，克隆的平均生长率为71%，检测率90%以上。初次筛选共有9孔为分泌抗体阳性孔，复测后 获取1株持续分泌特异抗体的杂交瘤株(克隆4E5)。经体外连续传代培养，液氮冻存半年以 上，复苏后生长良好，分泌抗体的性能稳定。

2.24E5的生产和纯化采用本室建立的腹水诱生方法生产单克隆抗体， 腹水形成的阳性率为80%，腹水的产量平均为7.9 ml/只小鼠。经Protein G亲和层析纯化后 ，抗体蛋白的含量平均为2.18 mg/ml腹水。

2.34E5的亚类及效价快速定性试纸分析法的结果显示，4E5在标准试 纸的IgG1处出现蛋白条带，表明单抗4E5属小鼠IgG1亚类。经免疫荧光法分析表明4 E5腹 水型单抗的效价为1∶1 000以上，纯化后抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为1 μg/ 5×10⁵细胞。

2.44E5的特异性竞争抑制试验的结果(见图1)，4E5能完全阻断标准抗 人B7-1单抗与抗原的反应。表明该单抗是B7-1的特异性抗体，且与标准抗体<