关键词: 全反式维甲酸；髓母细胞瘤；细胞分化；抗Fas抗体；凋亡

摘要目的：观察全反式维甲酸(RA)诱导分化前后，人髓母细胞瘤细 胞系Med-3对抗Fas抗体的反应特点并探讨其免疫治疗意义。方法：使用10 μmol/L的RA诱导Med-3细胞分化并在处理当时或第24、 48、72、 96 h，分别加入最终浓度为25,50，100，200和400 ng/ml的抗Fas抗体。结合 各组细胞Fas表达形式，分析其形态学，细胞动力学，克隆形成能力和死亡特点。结果：正常培养的Med-3细胞表达30 kD的可溶型Fas(sFas)。RA能促进 Med- 3分化和膜型Fas(mFas)表达，但不诱导凋亡。单纯抗Fas抗体处理对靶细胞无明显效应。RA 处理的同时或 不同时期加入抗体能在不同程度上诱发细胞凋亡；其中，以RA处理后第48 h加入200 ng/ml 抗体的凋亡诱导效果最佳。结论：RA通过上调mFas表达提高髓母细胞瘤细胞系的凋亡易感性。因此 ，RA与Fas相关性凋亡促进剂配伍可能有助于改善髓母细胞瘤的临床免疫和/或药物治疗现状 。

中国图书分类号R392.11R739.41

All-trans retinoic acid sensitizes human medulloblasto ma cells Med-3 to anti-Fas antibody mediated apoptosis

GUO Li,LIU Jia,LI Jun-Wei et al.

(Division of Molecular Biol ogy,Shenyang Medical College,Shenyang 110031)

AbstractObjective:It was aimed to highlight the pro-apo ptotic significance and immunotherapeutic value of the membrane type Fas(mFas)up -regulated in all-trans retinoic acid(RA)differentiated medulloblastoma cells Med-3.Methods:Med-3 cells were treated by 10 μmol/L RA f or 0,24,48 or 72 h,followed by the supplementation of anti-Fas antibody in t he final concentration of 25,50,100,200 or 400 ng/ml.The cell morphology ,growth and death pattern(s)were evaluated by multiple approaches.Results:RA could promote cell differentiation and mFas expression but not induce apo ptosis.Anti-Fas antibody alone had no biological effect on Med-3 cells but whe n combined with 10 μmol/L RA,showed pro-apoptotic activity in a dose-related fashion.The best apoptotic induction could be achieved in the cell population pr etreated by RA for 48 h.Conclusion:The RA enhanced apoptotic susceptibility of Med -3 cells is closely associated with mFas up regulation.The chemical activation o f Fas suicide system may be a novel regimen for medulloblastomas.

Ke y wordsAll-trans retinoic acidMedulloblastomaDifferentiation Anti-Fas antibodyApoptosis

髓母细胞瘤是最常见的儿童期颅内恶性肿瘤。由于该类肿瘤手术难以根除， 对常规放疗和化疗不甚敏感，故预后甚差。全反式维甲酸(RA)作为分化诱导剂已被广泛用于 多种癌症尤其是白血病的临床治疗^［1］。但有关它在人髓母细胞瘤治疗中的应用 尚少报道。我们近期发现，RA通过下调髓母细胞瘤内源性生长因子LIF表达和端粒酶活性而 促进人髓母细胞Med-3分化^［2］；尽管RA不诱导凋亡，但能修饰Fas基因表达和提高 Med-3细胞的化疗敏感性^［3］。已知，当尾端含有死亡决定簇(Death domain)的mFa s与其配体FasL或Fas抗体结合后，能在胞膜表面传递来自细胞内外的死亡信息^［4］ 。因此，进一步确认

1材料与方法

1.1细胞的培养和处理人髓母细胞瘤细胞系Med-3由日本神户大学医学 部神 经外科建立和惠赠。Med-3细胞以1×10⁶ ml^-1的初始浓度培养在37℃，5%CO₂和 含10%胎牛血清的伊格尔氏液10 cm培养皿或六孔板中，次日用于实验。

RA购自美国Sigma公司，用99%背景对照(DMSO)配制成最终浓度为100 mmol/L的RA储备液。兔 抗人Fas抗体为美国Sant Cruz公司产品。实验分4个步骤进行。步骤1：分8组；组1，正常培 养 ；组2，10 μmol/L RA；组3-7，分别用终浓度为25，50，100，200和400 ng/ml抗体处理 的细胞。步骤2：分6组；组1，正常培养；组2，10 μmol/L RA；组3-6，10 μmol/L RA 处理的同时，分别加入最终浓度为25，50，100和200 ng/ml的抗Fas抗体。步骤3：分12组； 组1，正常培养；组2，10 μmol/L RA持续处理；组3-6，分别在10 μmol/L RA处理后第 24，48和72 h加50 ng/ml抗体；组7-9，分别在10 μmol/L RA处理后第24，48，72 h加10 0 ng/ml抗体；组10-12，分别在10 μmol/L RA处理后第24，48和72 h加200 ng/ml抗体。 步 骤4：分5组；组1，正常培养；组2，10 μmol/L RA；组3，100 ng/ml抗体；组4，10 μm ol/L RA+100 ng/ml抗体和组5，10 μmol/L RA处理后第48 h加入100 ng/ml抗体。上述实 验均持续观察7 d，每组依实验需要设3-6皿。步骤1～4均重复2次(因步骤4内容在前3个 步骤中已涉及，实际是至少重复4次)。

为观察细胞在不同处理时间的形态学和/或Fas蛋白含量和分布的变化，先将15张左右灭菌盖 玻片放入其中一皿，再加入细胞。每隔24 h从各皿取玻片若干，用于各项指标检测。

1.2细胞形态学和增殖动力学观察采用的主要方法是：H/E染色，细胞 总数及死活细胞比值和反映细胞增殖情况的MTT比色法。实验步骤见以往所述^［2］。

1.3细胞死亡性质和凋亡指数的确定取细胞盖玻片，每组3张。多聚甲 醛固定后， 使用末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记法做原位DNA片段化分析(TUNEL)。根据细胞核， 质 ，膜的状态和凋亡小体形成与否，判定细胞死亡性质。从每张片选5个视野(×40)，分别记 录每百个细胞核中有凋亡改变者所占的比例，综合分析。

1.4改良的软琼脂培养和克隆形成能力测定按常规方法用20%胎牛血清( Gibco,USA)的2X EMEM培养液制备1.2%和0.6%的琼脂糖培养基。前者直接铺皿。从后者取 适量，分别添加最终浓度为10 μmol/L的RA或100 ng/ml的抗Fas抗体或10 μmol/L RA+10 0 ng/ml抗Fas抗体；再与终浓度为500个细胞/ml的正常培养细胞或RA处理后48 h的细胞充分 混匀后铺皿。每日记录细胞成活情况。观察持续3 w。将含有10个以上细胞的集落认定为一 个克隆。在低倍镜下计数集落数目，每组20个视野，取均值；按公式(克隆形成数目/接种细 胞数目×100)计算克隆形成率。

1.5抗Fas抗体与靶细胞结合特异性的分析正常培养或10 μmol/L RA 处理48 h后，更换无血清EMEM培养液。向各培养皿加入终浓度为100 ng/ml的抗Fas抗体。常 规孵育1 h后，去除培养液，用适量PBS冲洗3次，取细胞盖玻片若干；常规固定后，以3种方 式对正常和RA处理的细胞做ABC免疫组化学染色：1)在其它染色步骤不变的情况下，用等量P BS代替1抗和2抗，即1抗(-)/2抗(-)；2)1抗(-)/2抗(+)和3)1抗(+)/2抗(+)。

1.6统计学分析Fisher法分析各组细胞MTT测定、存活比率凋亡指 数和克隆形成能力间差异的显著性(P值)。

2结果

2.1RA明显提高Med-3细胞的凋亡易感性细胞形态学染色和TUNEL观察 以及在此基础上的凋亡指数测定显示：在5 d的观察期限内，正常培养的Med-3细胞罕见凋 亡；单纯RA处理可使靶细胞出现分化样形态学改变但不促进细胞凋亡(图1a)；Med-3细胞对 各浓度抗Fas抗体的处理无明显反应。相反，在RA处理的同时或处理后不同间期加入同样浓 度的抗体则在一定程度上诱导细胞凋亡(图1b)。如图2所示，经RA预处理的细胞对抗Fas抗体 的凋亡易感性更高；其中，以RA处理后第48 h加入200 ng/ml抗体的凋亡诱导效果最佳。

2.2RA对抗Fas抗体细胞杀伤效应的促进作用软琼脂克隆形成(细胞成活 )能力的测定结果(图3)表明：正常培养条件下，Med-3细胞具有克隆形成能力；单纯抗Fas 抗体的结果与前者相似；RA使克隆(10个细胞/集落)形成的时间延长和数目略下降(P＞0.05)；在RA和抗Fas抗体配伍处理组，未见细胞 克隆形成(P＜0.01)。经48 h RA预处理后，培 养 在含抗体软琼脂中的Med-3细胞在3 d内全部死亡(图略)。

2.3RA处理细胞的凋亡易感性与Fas的表达形式有关将100 ng/ml的抗Fa s抗体和正常培养或10μmol/L RA处理后48 h的Med-3细胞孵育1 h。而后，以3种方式 对 所收集的细胞载玻片做免疫组织化学染色。如表1和图4所示：在1抗(-)/2抗(-)的条件下， 两组细胞均无阳性标记；1抗(-)但2抗(+)时，正常培养细胞仍呈阴性，而部分RA处理的细胞 表面附有阳性标记物；1抗(+)和2抗(+)时，正常培养和RA处理细胞均阳染，但Fas蛋白的存 在方式明显不同；前者的Fas蛋白均匀分布于胞浆，而后者则主要位于细胞表面。从而证 实，RA对Med-3细胞的mFas表达具有明显上调作用。

图1Med-3细胞的TUNEL凋亡核标记

Fig.1TUNEL assay of medulloblastoma Med-3 cells

Note:(a)treatment with 10 μmol/L RA for 96 h;(b)pre-treatment with 10 μ mol/L RA for 48 h fol