关键词: T-淋巴细胞白血病细胞株；Molt-3；细胞凋亡；Caspase-3；FAS受体/配体

摘要目的：研究高三尖杉酯碱(HHT)诱导T-淋巴细胞白血病细胞凋亡的作用 机制 。方法：采用流式细胞仪等技术对HHT诱导T-淋巴细胞白血病细胞(Molt-3)的凋亡作 用进行探讨。结果：HHT诱导Molt-3凋亡，凋亡率与作用浓度和时间成正比；细胞被 阻 滞在G1期。HHT作用24 h后细胞内Caspase-3活性增高，Caspase-3 抑制剂Z-DEVD-FMK 能特 异地阻断HHT对Molt-3凋亡的诱导；Fas抗体可诱导细胞凋亡，但HHT对Fas受体/配体途径无 影响。结论： HHT对T-淋巴细胞白血病细胞的促凋亡作用和激活Caspase-3有关。

中国图书分类号R392.12R733.7

Homoharringtonine induced apoptosis in leukemic T-cells Molt-3 via activation of Caspase-3

CAI Zhen,LIN Mao-Fang

(Department of Hematology First Hospital of Zhejiang University,Oncology,and Tumor Immunology.)

Wolf-Dieter Ludwig et al.

(Robert-Roess le Clinic,Charité,Humboldt-University of Berlin,Germany)

AbstractObjective:To explore the mechanism of HHT-induc ed apoptosis in l eukemic T-cells Molt-3.Methods:Flow cytometry ，colorimetric assay and RT -P CR were used to analyse the HHT-induced apoptotic pathways.Results:We stud i ed dose- and time-dependent effects of HHT on cell viability, cell cycle distr ib ution, Caspase-3 activity as well as expression of Fas on Molt-3 cells. In the se cells, HHT-induced apoptosis was associated with G1 delay and correlated wit h the activation of Caspase-3. Treatment with Caspase-3 inhibitor prevent HHT -in duced apoptosis significantly.Pretreatment of Mo lt- 3 cells with HHT did not increase the susceptibility to apoptosis induced by cro sslinking of Fas receptors. Furthermore, Fas-L neutralizing antibodies (Nok-1 an d -2) did not affect HHT-induced apoptosis in these cells.Conclusion: HHT in duced apoptosis in Molt-3 cells involves the activation of Caspase-3 .

Key wordsT-cell line Molt-3Apoptosiscaspase-3Fas-receptor/li gand

细胞凋亡，又称程序性死亡，是细胞的一种生理性死亡过程。近年来研究表明它 在机体的许多生理病理过程中都起重要作用，多种抗癌药能诱导细胞凋亡。高三尖杉 酯碱( Homoharringtonine, HHT )是目前广泛用于临床治疗急性、慢性髓性白血病和骨髓 异常增生综合征 (MDS) 等的一线抗肿瘤药，而其对急性淋巴细胞白血病的治疗少见报 道。我们在体外实验发现HHT对T-淋巴细胞白血病细胞株有明显促凋亡作用 ，本文对其促凋亡机制作一探讨。

1材料与方法

1.1主要药物和试剂高三尖杉酯碱 (1 mg/ml ) 购自杭州民生药厂, 用 RPMI稀释至所 需浓度, 保 存于4℃。Caspase-3抑制剂 Z-DEVD-FMK购自CALBIOCHEM公司; 抗兔FAS 多 克隆抗体系BIOMOL Research Laboratories Plymouth Meeting (PA USA) 公司产品；抗人F AS IgM抗体 (CH11, IgM) 购自Immunotech，Marseille ( France)公司，抗人FAS配体抗体 ( NOK1、NOK2) 购于Pharmigen (USA)，Annexin-V^FITC由Genzyme (Germany) 公司 提供。

1.2细胞和细胞培养①细胞系：人T-细胞白血病细胞株Molt-3来自 德国Braunschweig 细胞中心。②细胞培养：在5％CO₂，37℃条件下，用含10％小牛血清，青霉素(100 U/ml) , 链霉素 (100 μg/ml) 的PRMI1640培养液中培养传代，实验用细胞均处于对数生长期。

1.3细胞凋亡和细胞周期检测收集2 ×10⁵细胞经 PBS 洗涤后，Annexin-V^FITC 5 μl和碘化丙碇 ( PI, 10 μg/ml) 染色，避光作用1 0 min， 流式细胞仪检测；然后细胞用70％预冷的乙醇固定30 min，DNase-free RNA酶处理30 mi n ，加 PI (100 μg/ml) 染色后，分析10 000个细胞，检测细胞周期和亚二倍体峰的DNA含量 。

1.4末端去氧核糖核酸片段标记 (TUNEL)细胞用1％多聚甲醛固 定和0.1%TritonX-100处 理后，按照 (Boehringer Mannheim，Germany )公司提供的试剂盒( In Situ Cell Death D etection Kit，Fluorescein)的要求标记经HHT处理的细胞，流式细胞仪FACScan (Becton Dickinson公司)分析DNA荧光-dUTP标记后DNA片段断裂的程度。

1.5流式细胞仪检测细胞APO表面抗原表达及抗APO/FAS和抗FAS配体作用 后的凋亡经HHT 处理的细胞4×10⁵，PBS洗涤后，加20％小牛血清培养液封闭，直接加入抗APO^PE 抗体避光作 用30 min，流式细胞仪检测,结果分析采用相对荧光密度(Relative Fluorescence Intensit y , RFI )；CH11 和NOK1，NOK2各2 μl (100 ng/ml) 加入2×10⁵ ml^-1细胞的培 养孔内，于37℃、5％CO₂ 孵箱作用24 h后测凋亡。

1.6半定量RT-PCR检测FAS-L mRNA表达总RNA制备按Promega公司提 供的试剂盒建议的步骤操作：逆转录反应作用在42℃，持续30 min。50 μl 的PCR反应液含 有4 μl的逆 转录反应产物，10 μmol/L特异引物以及1 U Taq DNA多聚酶。在DNA扩增仪上进行：94℃变 性2 min后，循环 40 次 ( 94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s)。然后取10 μl PCR产物 在1.5%凝胶上电泳，用DNA梯度标记 (Promega公司)。计算机Adoshop软件分析条带密度 ，内对照用GAPDH，基因表达强度是按 /GAPDH 的比率计算。 引物序列为：FAS-L fwd,5′-GGCAGAACTCCGAGAGCT-3′,rev,5′-CCAGAGAGA GCT CAGATACGT-3′,GAPDH fwd5′-CATCAGCAATGCCTCCTGCACC-3′，rev,5′-GTTG AAGTCAGAGGAGACCACC-3′。

1.7Caspase-3活性测定及Caspase-3 酶抑制剂作用于HHT处理的细胞 按Caspase-3 Colorimetric Assay Kit ( R & D System Inc)要求进行: 2×10⁶细胞溶于细胞溶解液50 μl后, 加入2×反应缓冲液50 μl和酶底物 (DEVD-pNA) 5 μl 37℃孵育1 h，用405 nm波长 分光光度仪(UV-1202, Shimadzu, Japan)测光密度 (O.D.)。在HHT作用细胞前2小时，预 加入100 μmol/L Z-DEVD-FMK。用流式细胞仪检测细胞凋亡是否受抑。

1.8统计学分析实验均用3复管，结果以均值±标准差表示；差异显 著性用配对t检验。

2结果

2.1HHT 诱导Mlot-3细胞凋亡不同浓度的HHT（2、10、50 ng/ml) 分 别作 用于细胞6、12、18、24 h后，凋亡率随着剂量加大和时间延长而增加；显示有剂量 和时间依赖性(图1)，另外我们用末端去氧核糖核酸片段 标记(TUNEL)进一步来证实HHT诱导的细胞凋亡，可见细胞凋亡后产生末端标有荧光-dUTP的 D NA断裂片段，用流式细胞仪检测，标有荧光的DNA片段染色增强(图2 )。经不同浓度的HHT作 用24 h后分析HHT作用后细胞周期的变化(图3 )，Molt-3细胞在 HHT 10 ng/ml时就可见S、G2/M期减少，同时出现高尖的G1期峰，及至50 ng/ml, 随着凋 亡细胞的大量出现G1峰减少，表明凋亡耗尽了G1期存活的细胞；同时凋亡细胞的G1期增多， 增宽；HHT作用使细胞阻滞在G1期。

2.2HHT不影响FAS配体/受体对Molt-3细胞的凋亡诱导作用由于许多 抗肿瘤药物 促凋亡是通过FAS途径传递凋亡信号的^［1］。因此我们对Molt-3细胞的细胞表面F AS 受体表达用流式细胞仪进行检测。HHT 0、 2、10及50 ng/ml作用后细胞的相对荧光密度 (RFI，x±s )分别为22.67±1.150 0、34.00±1.730 0、32.67±1.15 0 0和22.670 0±0.577 4，无诱导 FAS表达增强作用；细胞经抗人FAS单抗CH11作用后，显示凋亡，但HHT对CH11无协同或增强 作用；FAS配体中和抗体 ( NOK1、2 ) 对HHT作用的细胞凋亡无任何阻断作用 (图4)。RT-PCR结果表明Molt-3细胞的FAS-L表达阴性，而且HHT无诱导FAS-L表达(资料 未显示)。

2.3HHT通过激活Caspase-3诱导细胞凋亡现认为Caspase 在 细胞凋亡过程中发挥重 要作用，尤其是Caspase-3是整个凋亡过程的一个重要环节， Z-DEVD-FMK是Caspase-3 酶的特异性抑制剂。取经HHT作用后24 h的细胞上清液测得的Caspase-3 的活性 ，在 HHT 10 ng/ml和50 ng/ml水平，可观察到 Molt-3细胞的Caspase 酶的活性随着剂量加大而 增高 (图5)，提示Caspase-3在Molt-3细胞的凋亡过程 被激活；进一步用 Z-DEVD-F MK先于HHT与细胞作用，2 h后加入HHT继续作用20 h，用流式细胞仪测凋亡, 发现Caspase-3抑制剂能抑制Molt-3细胞的凋亡(图6)。

图1HHT诱导Molt-3细胞凋亡具时间和剂量依赖性

Fig.1HHT induced Molt-3 cells apoptosis:does-and time-dependent

图2末端去氧核糖<