关键词: 干扰素；HL-60细胞；耐药

摘要目的：探讨干扰素α对HL-60细胞增殖分 化与凋亡的作用及 特点。方法：MTT法测定细胞增殖性变化。NBT方法测定细胞分化程度。流式 细胞仪测定凋亡的发生程度。浓度递增法诱导HL-60细胞的维甲酸耐药性。结果：IFNα体外抑制HL-6 0细胞增殖，并与维甲酸产生协同抑制作用。IFNα可单独诱导HL-60细胞分化，又能增加 维甲酸诱导分化作用。单独IFNα无明显的诱导HL-60细胞凋亡作用。维甲酸耐药HL-60细 胞 经IFNα作用3 d后，可明显恢复其对维甲酸的反应性。结论： IFNα既能促进 维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用，又可逆转HL-60的维甲酸耐药性。

中国图书分类号R733.71

Study of IFNα effect on HL-60 ce lls or ATRA resistant HL-60 cells

JIANG Guo-Sheng，TANG Tian-Hua，ZHANG Yu-Kun et al.

(Department of Hematology and Oncology,Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062)

AbstractObjective: To detect in vitro the effect of IFNα on HL-60 cells or ATRA res istant HL-60 cells.Methods: MTT was used to measure the proliferation of HL-60 ce lls or ATRA resistant HL-60 cells.The differentiation of HL-60 cells or ATRA res istant HL-60 cells was detected by NBT.To detect the apoptosis of HL-60 cells or ATRA resistant HL-60 cells with Flow Cytometric Analysis.Otherwise,the ATRA r es istant HL-60 cells was induced by way of ATRA density gradually-increasement.Results:IFNα could inhibit the p roliferation of HL-60 cells,especially accompanied with the ATRA. IFNα not on ly i nduce the differentiation but also promote the differentiation of HL-60 cells o r ATRA resistant HL-60 cells.ATRA resistant HL-60 cells post-treatment with IFNα were sensitive to ATRA.Conclusion: Effect on differentiation of HL-60 cells was enhanced by IFNα. IFNα also reverse the resistance of ATRA resistant HL-60 cells to ATRA.

Key wordsIFNαHL-60 cellResistance

自1986年国内首创全反式维甲酸(ATRA)治疗 急性早幼粒细胞白血病(APL)获得成功 以来^［1］，肿瘤诱导分化模式引起了国内外学者新一轮的广泛关注。其中本文实验 中，ATRA诱导HL-60细胞可产生耐药性，影响了ATRA的进一步有效作用^［2］。因此 ， 正如化疗药物一样，如何逆转该耐药成为研究的热点之一。IFN是重要的生物活性因子，不 仅抑制肿瘤细胞生长，并证实有逆转化疗药物耐药的作用。为探讨它在诱导分化剂中的作用 ，本研究对IFNα在HL-60或其耐药细胞之间的作用特点，做了深入研究，现总结报道如下 。

1材料与方法

1.1细胞来源

1.1.1HL-60细胞山东省医学科学院免疫室张玲研究员赠送，本室自 行传代培养。

1.1.2耐ATRA的HL-60细胞HL-60细胞生长至对数增殖期，调整至2× 10⁶ ml^-1，以0.1 ml细胞悬 液加入96孔板中，然后加入ATRA，自1×10^-9mol/L开始，按倍增浓度换液培养，至H L-60 细胞良好生长于1×10^-6mol/L为止。以极限稀释法克隆，反复3次，稳定生长良好， 则ATRA耐药HL-60细胞诱导成功，称为ATRA耐药HL-60细胞。

1.2细胞增殖实验

1.2.1IFNα(300万U/支，USA)对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞增殖影响 收集对数生长期 HL-60或者ATRA耐药HL-60细胞，调至5×10⁶ ml^-1，以0.1 ml加入96孔培养板中 ，再加入0. 1 ml IFNα溶液(250 U/ml,500 U/ml…8 000 U/ml)。37℃,5%CO₂培养72 h。按文献MTT 法进行测定 细胞增殖性，设3复孔。

1.2.2IFNα对L-CFU形成影响按半固体琼脂法培养^［3］。即 调HL-60或ATRA耐药HL-60 细胞至1×10⁵ ml^-1，按该细胞悬液0.35 ml，2×MC COYSA 0.55 ml，0.1%PHA 1 ml混合，37℃ ,24 h。加上述IFNα 0.2 ml，0.6%Agar 1.9 ml，每浓度浇3只平皿。CO₂孵育培养7 d，观察结果，计算集落数。

1.3IFNα对HL-60细胞分化的作用对数生长期HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞调至5×10⁵ ml^-1，培养 于 含上述不同浓度IFNα培养液中，37℃,5%CO₂,72 h，取1 ml细胞悬液，加NBT溶液1 ml( 1 mg/m l),TPA 200 ng,混匀，37℃5%CO₂,1 h,1 000 r/min 5 min，沉淀细胞涂片，瑞氏染色 ，油镜计200个细胞，计阳性率。

1.4IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞凋亡影响调对数生长期HL-60或ATRA耐药HL-60细胞为1×10⁶ ml^-1，0.1 ml加 入96 孔板中，加上述不同浓度IFNα 0.1 ml,37℃,5%CO₂，饱和温度培养36 h，收集细胞 ，按流式细胞仪分析DNA含量变化，形态学观察凋亡现象。

1.5IFNα在ATRA诱导HL-60或ATRA耐药HL-60细胞中的作用选择2×10³ U/ml，0.1 ml IFNα加入96孔板中，再加入ATRA耐 药 HL-60细胞，培养48 h后(37℃,5%CO₂)，RPMI1640洗3遍(1 000 r/min 5 min)调细胞 数 1×10⁶ ml^-1，0.1 ml/孔加入96孔板中，加0.1 ml不同浓度的ATRA(10^-9 …10^-4mol/L)继续 培养72 h，前述MTT或NBT法测定。设HL-60细胞和ATRA耐药HL-60对照组。

2结果

2.1IFNα对HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞 增殖影响图1中，IFNα随浓度加大，对HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞抑制作用增强。对HL-60细 胞或ATRA耐药HL-60细胞分别在1×10³ U/ml和2×10³ U/ml时开始产生明显抑制作用( P＜0.05)。

图1IFNα对HL-60细胞或ATRA耐药HL-60细胞增殖影响

Fig.1Effect of IFNα on proliferation of HL-60 cells or ATRA resistan t HL-60 cells

图2IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞L-CFU形 成影响

Fig.2Effect of IFNα on L-CFU colonys of HL-60 cells or ATRA resista nt HL-60 cells

图3IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞分化的诱 导作用

Fig.3Effect of IFNα on differentiation of HL-60 cells or ATRA resist ant HL-60 cells

图4ATRA对IFNα处理后ATRA耐药HL-60增殖作用

Fig.4Effect of ATRA on ATRA resistant HL-60 cells treated with IFNα

图5ATRA对IFNα处理后ATRA耐药HL-60细胞分化影 响

Fig.5Effect of ATRA on ATRA resistant HL-60 cells treated with IFNα

2.2IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞L-CFU形成的影响图2显示，1×10³ U/ml IFNα以上浓度可明显抑制HL-60或ATRA耐药HL-60细胞的L-CFU 形成。

2.3IFNα对HL-60或ATRA耐药HL-60细胞分化的诱导作用由图3表明，IFNα浓度在2×10³ U/ml以上，与低浓度组比，具有明显的诱导分化作用。

2.4IFNα在ATRA诱导HL-60或ATRA耐药HL-60细胞中的作用

2.4.1ATRA对IFNα处理后ATRA耐药HL-60细胞增殖影响由图4显示，IFNα作用后的ATRA耐药HL-60细胞在体外恢复了明显的反应敏感性，表现为抑 制作用。

2.4.2IFNα对ATRA耐药HL-60细胞的分化作用图5显示，ATRA耐药HL-60细胞经IFNα作用后，体外受ATRA作用可产生诱导分化性。尤以AT RA在10^-6 mol/L以上浓度明显(P＜0.05)。

3讨论

干扰素为重要的细胞因子，业已证实具有抑制病毒，免疫调节及抑制肿瘤等作用 ^［4］。尤其基因工程的发展，使重组干扰素成为现实后，推动了其临床应用及体外实验 的进展。如近年来，IFNα在化疗药物耐药中的逆转作用就是典型的例子^［5］。另外 ，诱导分化剂ATRA