关键词: 大鼠；佐剂性关节炎；免疫功能

摘要目的：阐明佐剂性关节炎(AA)大鼠模型免疫病理特征及发病机理。方法：应用弗氏完全佐剂诱发大鼠产生踝关节佐剂性关节炎，研究其免疫功能变化。结果：AA大鼠致敏侧及对侧后肢踝关节均发生明显炎性肿胀，其脾细胞对SRBC诱导的抗体生成反应明显增强，但其脾细胞对PWM诱导的IgG的产生及血清类风湿因子(RF)水平与对照组相比并无升高。AA大鼠对Con A诱导的脾细胞增殖反应较对照组显著降低，脾细胞抑制活性降低，CD8⁺比例较对照组增高，模型大鼠脾细胞IL-2 mRNA表达水平较对照组明显增高，IFN-γ，IL-10及IL-4 mRNA表达水平则明显降低。结论：细胞免疫功能紊乱，尤其是Th1和Th2、Th和Ts之间的平衡紊乱是AA大鼠免疫功能异常的重要特征之一。

中国图书分类号R730.52

A study of the immune function of adjuvant arthritis rats

FANG Jian，ZHANG Yong-Xiang，RU Xiang-Bin

（Institute of Pharmacology and Toxicology， Beijing 100850）

AbstractObjective:To study the immune characteristic and pathological feature of adjuvant arthritis rats.Methods:Rat arthritis was induced by intracutaneously injection of complete Freud's adjuvant (CFA) in the right hind foot pat of rat and immune function of Adjuvant Arthritis (AA) rats was studied.Results:It was found that both of the hind ankle joints were swollen after CFA injection and the antibody production response to the challenge of sheep red blood cells (SRBC) in plaque-forming cell (PFC) was significantly enhanced in AA rats. However， IgG production of splenocytes induced by pokeweed (PWM) and the serum level of rheumatoid factor (RF) were not altered compared with control rats. The splenocytes proliferation induced by ConA and the activity of Ts were significantly reduced， but the proportion of CD8⁺ of the splenocytes was markedly increased in AA rats. In reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)， it was shown that the expression level of IL-2 mRNA was significantly elevated， but expression levels of IFN-γ， IL-10 and IL-4 were significantly decreased in AA rats. Conclusion: Imbalance of cell-mediated immunity， especially the imbalances of the Th1/Th2 and Th/Ts， is one of the main pathological characteristics of AA rats.

Key wordsRatsAdjuvant arthritisImmune function

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一类严重危害人类身体健康的常见自身免疫性疾病，病因不明，病理表现复杂多样，目前临床尚无理想的治疗方法，是当今医学研究领域的热点之一。佐剂性关节炎（Adjuvant Arthritis， AA）大鼠是研究类风湿性关节炎(RA)及评价防治RA药物的常用动物模型之一，其病理表现与RA有一定的相似之处，如病变关节肿胀，细胞免疫功能异常等^［1］，但其免疫病理特征及发病机制目前仍不十分清楚。因此，阐明其免疫病理特征及发病机理，对于更为恰当地应用该模型具有重要实际意义。本文对AA大鼠的免疫功能变化及其发生机制进行了研究。

1材料与方法

1.1实验动物Wistar大鼠，雄性，160～200 g，军事医学科学院动物中心提供。

1.2主要试剂刀豆蛋白A(Con A)，Sigma公司；卡介苗，卫生部生物制品检定所；RPMI-1640培养基，Gibco公司；新生小牛血清(NCS)，本院放射医学研究所；³ H-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)，中国原子能研究院同位素研究室；补体，为豚鼠血清。成年豚鼠，股动脉取血，离心，获得新鲜豚鼠血清，-80℃保存；美洲商陆(PWM)，Sigma公司。小鼠抗大鼠T细胞分化抗原单克隆抗体(进口分装)，荧光标记羊抗小鼠IgG抗体，邦定生物医学公司；辣根过氧化酶标记兔抗大鼠抗体，兔抗大鼠IgG抗体，纯化兔IgG抗体，本院微生物与流行病研究所。

1.3主要仪器二氧化碳孵温箱，日本池本理化株式会社；液体闪烁计数仪，LKB公司；HITACHI 20PR-5型低温常速离心机，日本日立公司；高速离心机，本院仪器厂；MCC/340型酶标仪，美国FLOW公司；XHF-1型高速分散器，上海兴华电子仪器厂。

1.4方法

1.4.1 AA大鼠模型的制备 参见文献［1］，取羊毛脂与石蜡油(1：2)，加热混匀，高压灭菌后4℃保存，使用时加入卡介苗(10 mg/ml)，配制成弗氏完全佐剂(CFA)，大鼠右足垫皮内注射(0.05 ml/只)致敏大鼠，原发病变表现为致炎侧的关节肿胀，致敏后即可出现，继发病变一般于致炎12～14 d后出现，表现为非致炎侧及双前肢的关节肿胀。

1.4.2 溶血空斑实验^［2］ 实验前4天动物以绵羊红细胞(SRBC)致敏（ip，5×10⁹/只〕，实验时断头取脾，制备1.5×10⁶ ml^-1的细胞悬液，并加入适量绵羊红细胞及补体，取混合液灌入玻片小室，37℃温育1 h，计数小室内溶血空斑数，结果以空斑数/10⁶脾细胞表示。

1.4.3 脾淋巴细胞增殖反应 参见文献［3］，动物断头取脾，制备5×10⁶ ml^-1的细胞悬液，取0.1 ml悬液与等体积1640液或Con A（终浓度为2.5 μg/ml)加入96孔培养板内， 二氧化碳孵温箱温育54 h，加入［³ H］TdR，继续培养至72 h后用多头细胞收集仪收集细胞，80℃烘干后液体闪烁计数仪测cpm值。

1.4.4 脾细胞抑制活性测定 以抗体生成反应为指标，观察大鼠脾细胞抑制活性。以SRBC致敏大鼠，4 d后断头取脾，制备2.5×10⁶ml^-1的细胞悬液，为指示细胞(A)。另取未致敏对照组(B)及AA组(C)大鼠同法制备脾细胞悬液，为待测细胞。实验共设置3个组，分别为空白对照组（A组脾细胞+等容积培养液），对照组（A组脾细胞+B组脾细胞），实验组（A组脾细胞+C组脾细胞），B及C组脾细胞均为2.5×10⁶ml^-1。然后按溶血空斑实验方法检测抗体生成反应，结果以空斑数/10⁶脾细胞表示。

1.4.5 脾细胞培养上清中IgG水平的检测参照文献应用ELISA法检测脾细胞培养上清中的IgG水平^［4］。取AA及正常大鼠，无菌取脾，制细胞悬液，用Tris-NH₃Cl去除红细胞，调整浓度为2.5×10⁶ml^-1，另配制80 μg ml^-1的美洲商陆，各取0.1 ml加入96孔板内，于CO₂培养箱内37℃培养7 d后，离心收集上清，-20℃保存备用。实验时用羊抗大鼠IgG包被聚苯乙烯板，依次加入0.05 ml脾细胞培养上清、0.1 ml羊抗大鼠酶标抗体，反应后加入底物，在酶联免疫检测仪测定光密度，结果用酶标指数(Enzyme Index，EI)表示。

EI＝(被测组血清OD值)/(对照组血清OD值+3s)×100

1.4.6 类风湿因子（RF）检测取纯化兔IgG溶于PBS液中，63℃热变性20 min，加入0.36 mol/L的Na₂SO₄盐溶液沉淀，10 000 r/min离心20 min，弃上清，取沉淀溶于包被液中(20 μg/ml)，包被聚苯乙烯板4℃过夜，检测待测血清中RF因子水平，ELISA实验方法同前，结果以酶标指数(Enzyme Index，EI)表示。

EI＝(被测组血清OD值)/(对照组血清OD值+3s)×100

1.4.7 细胞亚群检测 应用流式细胞仪(FACS)参照文献［5］进行。

1.4.8 脾细胞细胞因子mRNA表达水平的检测 应用RT-PCR技术检测脾细胞细胞因子mRNA表达水平。参照文献［6，7］方法，选用β-actin为外标，在β-actin、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-gamma序列的5′、3′分别设计上下游引物，β-actin：5′ ctatcggcaatgagcggttc3′，5′cttaggagttgggggtggct3′； IL-2 5′gcgcacccacttcaagccct3′，5′ccaccacagttgctggctca3′； IL-4： 5′atgcaccgagatgtttgtacc3′，

5′tttcagtgttctgagcgtgga3′；IL-10： 5′tgccttcatcaagtgaagact3′，5′aaactcattcatggccttgta3′； IFN - gamma ， 5′ccctctctggctgttactgc3′，5′ctccttttccgcttccttag3′。总RNA提取、反转录PCR、电泳实验参见文献［8，9］进行。

1.4.9 统计学处理 所有实验数据均以均数±标准差（x±s）表示，组间差异采用t检验分析判定。

2结果

2.1 AA大鼠致敏后后肢踝关节的变化AA大鼠于致敏后第22天用容积法测量踝关节肿胀度。结果表明，致敏侧即原发病变侧和对侧即继发性病变侧的后肢踝关节与正常对照组相比均发生了明显肿胀，结果见表1。

2.2AA大鼠抗体生成反应能力的变化AA大鼠于致敏后22 d检测脾细胞抗体生成反应。结果如图1所示，AA大鼠脾细胞对SRBC诱导的抗体生成反应能力较对照组明显增强，溶血空斑(PFC)数明显增加(图1)。

表1AA大鼠后肢踝关节肿胀度

Tab.1The hind ankle joints swelling of AA rats