摘要目的：构建抗CD₂₀嵌合抗体Fab片段表达载体，并在大肠杆菌中进行高效可溶性分泌表达。方法：利用PCR方法从抗CD₂₀单链抗体(ScFv)表达载体上扩增抗CD₂₀抗体轻链可变区基因(V_L)、重链可变区基因(V_H)，然后将V_H、V_L基因重组到Fab表达载体pYZF中，构建抗CD₂₀Fab表达载体pYZF1cd20，并在27C7菌中高效表这。结果：经Fab表达载体转化的27C7菌株，进行表达培养，经分离纯化获得具有CD₂₀特异结合活性的Fab片段，竞争性免疫荧光抑制实验表明，表达产物Fab片段能竞争性抑制鼠源性抗CD₂₀抗体HI₄₇和CD₂₀表达细胞Raji细胞结合。结论：在大肠杆菌中高效可溶性分泌表达有活性的抗CD₂₀嵌合抗体Fab片段。

中国图书分类号R392.12

High expression of the chimeric antibody Fab against-CD₂₀ in E.coli and bioactivity determination

LAI Zeng-Zu，XIONG Dong-Sheng，FAN Dong-Mei

（The National Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Tianjin 300020）

AbstractObjective:Construct the expression vector of the chimeric antibody Fab fragment against CD₂₀ and express in E.coli.Methods:Amplify the gene of the variable region of heavy chain(V_H) and light chain(V_L)of the antibody against CD₂₀ from the anti-CD₂₀ single chain Fv antibody fragment(ScFv)expression vector by PCR method,clone the V_H，V_L into the plasmid pYZF to construct the Fab expression vector pYZF1cd20,transformate 27C7 with pYZF1cd20,and the expression of Fab in 27C7.Results:The CD₂₀ binding Fab was expressed, isolated and purified,the competitive inhibition of immune fluorescence experiment show that the Fab inhibits the binding of monoclonal antibody HI₄₇ to CD₂₀ on the surface of Raji cell.

Key wordsMonoclonal antibodyChimeric Fab antibody framentCD₂₀

作为B淋巴细胞表面膜蛋白，CD₂₀与B淋巴细胞Ca²⁺的跨膜传导密切相关，CD₂₀对B淋巴细胞的增殖和分化具有调节作用^［1］。由于CD₂₀仅在前-B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达，而在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织均无CD₂₀的表达^［2-4］，在人体血清中亦无游离CD₂₀的存在^［5］。因此CD₂₀可作为B淋巴细胞瘤治疗的一个很好治疗靶点。1997年以CD₂₀为靶点的嵌合抗CD₂₀单克隆抗体Rituxan已获准应用于B淋巴细胞瘤临床治疗^［6］。这是单克隆抗体研究的又一个里程碑。单克隆抗体HI₄₇(IgG₃)是我所于1990年研制成功的抗CD₂₀鼠源性单克隆抗体，第四届国际人类白细胞分化抗原会议将HI₄₇命名为CD₂₀＋X^［7］。本研究目的在于利用基因工程方法将鼠源性抗CD₂₀单克隆抗体HI₄₇可变区和人源抗体恒定区连接起来，构建嵌合抗CD20抗体Fab片段，以降低鼠源性抗体的免疫源性，并在大肠杆菌中可溶性分泌表达嵌合抗CD₂₀抗体Fab片段，以利于临床应用。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌体与材料抗CD₂₀ScFv表达载体由我室构建(另文发表)，pYZL、pYZH1载体、表达载体pYZF为我室构建，大肠杆菌27C7由我室保存。

1.1.2酶与试剂Taq酶购于上海生物工程公司，Protein G Agrose亲和柱，限制性内切酶Apa I、Mlu I、Nhe I、Spe I、Sph I、Sty I购于GIBCOBRL公司，抗CD₂₀单克隆抗体HI₄₇、抗CD₃单克隆抗体HIT3a、FITC标记的羊抗鼠IgG由我所免疫室提供，兔抗人IgG(Fab')₂单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，购于北京中山生物工程公司。

1.1.3细胞系Raji细胞由我室保存，用RPMI1640培养基培养。

1.1.4培养基2×YT培养基：蛋白胨1.6%，酵母膏1%，氯化钠0.5%，pH7.4。AP₅培养基：每1 000 ml含酸水解酪蛋白11 g，酵母膏0.6 g，硫酸镁0.19 g，葡萄糖1.5 g，氯化铵1.07 g，氯化钾3.73 g，氯化钠1.2 g，1 mol/L三乙醇胺(pH7.4)120 ml，过滤灭菌。细菌周质腔蛋白提取液：三羟甲基氨基甲烷25 mmol/L，乙二胺四乙酸1 mmol/L，20%蔗糖(W/V)，氯化钠200 mmol/L，苯甲基磺酰氟0.01 mmol/L，pH7.5。引物：①V_H5’端引物GCTACAAACGCGTACGCTCGGTGAAGCTG(MluI)，②V_H3’端引物GACCGATGGGCCCTTGGTGGSGGCTGAGGAGACGGT(ApaI)，③V_L5’端引物GCTACAAACGCGTACGCTGACATCGAGCTC(MluI)，④V_L3’端引物TTTCAGCTCCACCTTGGTCC(StyI)，下画线为括号内的内切酶酶切位点。

1.2抗CD₂₀Fab表达载体构建利用PCR法从抗CD₂₀ScFv表达载体上扩增V_H、V_L基因，经琼脂糖电泳分离纯化后，分别以MluI+ApaI、MluI+StyI消化，然后重组到带有人免疫球蛋白相应CH₁、C_L的pYZH1、pYZL载体相应的内切酶位点中，用所得的重组子pYZH1cd20、pYZH1cd20转化27C7菌株，扩增培养后提取pYZLcd20、pYZH1cd20质粒，分别以MluI+NheI，SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZH1cd20，琼脂糖电泳分离纯化含V_L、V_H的相应DNA片段，利用NheI、SpeI同裂酶的特点，将这两个片段和经MluI+SphI消化所得的pYZF载体片段连接成抗CD₂₀Fab表达载体pYZF1cd20(见图1)。

1.3抗CD₂₀Fab片段可溶性表达及分离纯化将载体pYZF1cd20转化27C7菌株，挑取单菌落接种5 ml含氨苄青霉素50 μg/ml的2×YT培养基，37℃，200 r/min，振荡培养6 h，至OD₆₀₀＝0.6；6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌株，将菌株重新悬浮于20 ml含氨苄青霉素50 μg/ml的AP₅培养基，30℃，250 r/min，振荡培养20 h；6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌体，将菌体于-20℃冻存1 h，化冻后加1 ml细菌周质腔蛋白提取液，混匀，置于4℃轻摇1 h，12 000 r/min，4℃离心20 min，取上清，用Protein G Agrose亲和柱分离纯化Fab。

1.4蛋白质印迹实验(Western-blot)^［8］12%SDS-PAGE电泳Fab表达产物，后将其转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶溶液4℃封闭过夜，加一抗兔抗人IgG(Fab’)₂，4℃，孵育2 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，加二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，4℃，孵育2 h，Tween Tris缓冲盐溶液(TBST)洗3次，每次10 min，然后用二氨基联苯胺(DAB)进行显色。

1.5竞争性免疫荧光抑制实验将浓度为20 μg/ml的HI₄₇溶液和1×10⁶Raji细胞在4℃下孵育1 h，2 000 r/min，4℃离心8 min，弃上清，PBS洗细胞3次，将细胞重悬于30 μl浓度为40 μg/ml Fab溶液，4℃放置1 h，2 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，PBS洗细胞3次，将细胞重悬30 μl按效价稀释好的羊抗鼠IgG-FITC溶液，4℃放置1 h，2 000 r/min，4℃离心10 min，弃上清，PBS洗细胞3次，FACS测定。

2结果

2.1抗CD₂₀Fab表达载体构建利用PCR法从抗CD₂₀Fab表达载体上扩增V_H、V_L基因，将V_H、V_L基因重组到表达载体pYZF的相应酶切位点中，构建嵌合抗CD₂₀Fab片段表达载体pYZF1cd20，核酸序列测定结果表明V_H、V_L基因正确重组到表达载体pYZF相应的酶切位点中。

图1表达载体pYZF1cd20的结构

Fig.1Map of the expression vector pYZF1cd20

图2SDS-PAGE电泳分析

Fig.2SDS-PAGE analysis

Note:A.unreduced condition;1.periplasm extract;2.purified Fab;B.reduced condition;1.periplasm extract;2.purified Fab

3Western-blot检测

Fig.3Detection of Western blot

Note:1.periplasm extract;2.purified Fab

2.2抗CD₂₀Fab在大肠杆菌中可溶性分泌表达及分<