摘要目的：细胞表面表位包埋法(SEM)是一种选择细胞表面特定的表达分子制备单克隆抗体的新途径。由于P185^neu/c-erbB-2是乳腺癌及其他肿瘤的一个重要表面标志，这个研究旨在应用SEM法制备特异性好，灵敏度高的P185单克隆抗体并分析其特性以便于临床。方法：采用细胞表面表位包埋法免疫BALB/C小鼠，常规杂交瘤技术进行细胞融合，ELISA法测定，有限稀释法克隆化。结果：筛选得到3株能稳定分泌抗人癌基因erbB-2产物P185蛋白的McAb杂交瘤细胞。经间接免疫过氧化物酶染色和流式细胞术分析证明该McAb特异性与P185阳性细胞膜结合，而不与结构类似的EGFR膜阳性细胞结合。免疫印迹实验证明这些McAb特异地与P185蛋白结合，病理切片免疫组化结果证明该单抗对乳腺癌组织呈特异膜阳性反应。结论：SEM法制备的肿瘤表面抗原P185的McAb杂交瘤具有很好的用于临床诊断肿瘤抗原P185的价值及工程化改造的前景。

中国图书分类号R392-33R730.3

Generation and characterization of monoclonal antibodies specific for the oncogene product P185^neu/c-erbB-2 by surface epitope masking(SEM)

WANG Chen，LI Yun，LI Ping

（School of Life Science University of Science and Technology of China,Hefei 230027）

AbstractObjective:Surface epitope masking(SEM) is a new approach for selective production of monoclonal angibodies reacting with defined cell surface expressed molecules. Since P185^neu/c-erbB-2 protein is an important surface marker of breast cancer and other cancers.This study was to prepare and characterize McAb against P185^neu/c-erbB-2 with high specificity and sensitivity by SEM for clinical application.Methods:Using the method of Surface epitope masking(SEM)immunized BALB/C mouse with T6-17 cells which are NIH/3T3 transfected with meu/c-erbB-2 oncogene.Fused the cells with the standard hybridma technique.Performed ELISA screen to test the hybridomas'quality,limited dilution for cell cloning.Results:Three hybridomas which can steadly secret McAb against P185^neu/c-erbB-2protein were obtained.The indirect immuno-HRP staining,flow cytometry analysis indicated that these three McAbs bind specifically to the P185 membrane positive cells,but not EGFR membrane positive cells.Western blotting indicated that they all bind specifically to P185 protein.Immunohistochemistry test showed positive staining for the sections of breast cancer tissue specifically.Conclusion:These three McAbs are highly valued for clinic diagnosis and engineering.

Key wordsneu/c-erbB-2 oncogeneP185Monoclonal antibody(McAb)Surface-epitope masking (SEM)

癌基因neu/c-erbB-2编码的蛋白P185是一个具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于受体酪氨酸激酶家族中生长因子受体(EGFR)家族。P185在乳腺癌，卵巢癌，胃癌，结肠癌，前列腺癌等肿瘤组织上的表达情况与肿瘤的分级密切相关，报道最多的是乳腺癌与P185表达的相关性：约有20%～30%的乳腺癌病人的肿瘤组织呈P185高表达，这类病人肿瘤浸润性高，复发可能性大，总的存活期短。临床上可以将P185的表达水平作为一个仅次于淋巴结损伤的独立的预后指标^［1，2］。但目前我国使用的抗体诊断试剂均为进口，价格昂贵，来源不稳定。因此，尽快研制并开发出灵敏度高，特异性好的国产抗P185单抗用于常规诊断，无疑具有十分重要的实际意义。本实验室采用细胞表面表位包埋法(Surface-epitope masking，简称SEM法)^［3］进行免疫来制备肿瘤细胞表面蛋白P185的单克隆抗体，并对它们的性质进行了研究。

1材料与方法

1.1细胞株SKBR-3为细胞膜上高表达P185的人乳腺癌细胞株；MCF-7，为细胞膜低表达P185的人乳腺癌细胞株。T6-17是NIH/3T3转入neu/c-erbB-2基因而成，其膜表面高表达P185。NE91是由NR6纤维母细胞转入EGFR基因而成，其细胞膜上高表达EGFR。以上几株细胞由美国宾州大学医学院病理和实验医学系Mark Greene教授惠赠。骨髓瘤细胞SP2/0及NIH/3T3细胞来源于中国科学院上海细胞库。

1.2实验动物8～12周龄的BALB/C小鼠。由中国科学院上海实验动物中心提供。

1.3动物免疫与杂交瘤细胞株的制备采用细胞表面表位包埋法(SEM法)，将T6-17细胞用经NIH/3T3细胞免疫的BALB/C小鼠的抗血清包埋后，对BALB/C小鼠进行免疫，其余按常规细胞融合步骤进行^［4］。用ELISA法规定杂交瘤上清，有限稀释法筛选强阳性克隆。

1.4ELISA法筛选阳性克隆及检测抗体效价^［5］以细胞裂解液作为包被抗原。收集T6-17细胞和NIH/3T3细胞分别用于阳性和阴性对照，经超声破碎获抗原溶液。再依次加入免疫鼠血清或杂交瘤上清及第二抗体羊抗鼠IgG-HRP(国产，华美公司)，最后加OPD底物显色，OD492nm测定吸收值。

1.5抗体的纯化和亚类测定将杂交瘤细胞5×10⁶接种于BALB/C小鼠腹腔制取腹水，然后采用辛酸沉淀杂蛋白和硫酸铵沉淀抗体的两步沉淀法纯化腹水中的抗体。SDS-PAGE检验其纯度，OD280nm测其蛋白浓度。使用上海生物制品所生产的ELISA抗体亚类检测试剂盒对抗体亚类进行测定。

1.6间接过氧化物酶和免疫荧光法测McAb的细胞染色特性免疫过氧化物酶染色步骤如下：将已培养2～3 d，细胞密度为50%的盖玻片加固定液(3%甲醛，PBS)室温下固定。滴加50 μl以封闭液稀释的腹水(或纯化的单抗)，湿盒中室温温育1.5 h。洗涤3次，再在盖玻片上滴加50 μl以封闭液1：200稀释的羊抗鼠IgG-HRP，湿盒中室温温育1.5 h。用PBS洗涤3次，稍微晾干，加底物溶液(0.05%DAB，0.03%H₂O₂，0.05 mol/L Tris-HCl，pH7.6)显色，室温10 min，肉眼可见棕色。用封片液封片，显微镜下观察。

流式细胞仪FACS分析步骤如下：分别收集5×10⁵NIH/3T3和T6-17细胞，FACS缓冲液洗3次，加单抗冰上温育1 h，再加羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗温育1 h，洗涤3次后，用0.2%多聚甲醛固定40 min，悬于PBS液中，采用FACS Calibur型流式细胞仪(美国 Becton-Dickinson)分析。

1.7免疫印迹法(Western Blotting)^［6］检测McAb的P185蛋白结合特性收集生长良好的细胞，加入裂解缓冲液(50 mmol/L pH7.5 Tris-HCl，1% Triton 100，150 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA 1 mmol/L PMSF)裂解，12 000 r/min离心2 min，取上清进行SDS-PAGE 电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上。加入适当稀释的腹水或纯化的单抗，再加入羊抗鼠IgG-HRP温浴，然后依次加荧光底物A(4 ml 1.5 mol/L Tris-HCl pH9.0，160 μl6.8 mmol/L Counamic Acid,30 μl 100 mg/ml Luminal)，荧光底物B(4 ml 1.6 mol/L Tris-HCl pH9.0,8 μl 30%H₂O₂，Sigma公司)。最后X光片感光，显影，定影。

1.8石蜡切片S-P法免疫组化分析取安徽医科大学附属医院乳腺癌组织进行免疫组化染色。石蜡切片脱腊至水，PBS洗涤，3%H₂O₂甲醇室温10 min。PBS洗后用10%的非免疫动物血清室温下10 min，吸去多余液体。加1：600～800稀释单抗(稀释液为0.01 mol/LpH7.4 PBS)37℃过夜，按常规S-P法程序进行免疫组化染色。每次染色用进口商品化的抗P185多克隆抗体做对照，SKBR-3和T6-17以及NIH/3T3和MCF-7、NE91作为细胞对照。

2结果

2.1杂交瘤细胞株的建立及稳定性测定经细胞表面表位包埋法(SEM法)免疫BALB/C小鼠，采用传统的细胞融合技术和ELISA法测定杂交瘤上清，经过4次有限稀释克隆，我们筛选得到了3株阳性杂交瘤细胞株，分别命名为A18，A21和A22。1年内杂交瘤细胞冻融3次，滴度一直保持在1：1×10⁶～1：1×10⁷。支原体的检测显示此3株杂交瘤均为支原体阴性。

2.2抗体的纯化和亚类测定用辛酸沉淀技术，我们得到纯度在90%以上的抗体，电泳结果如图1所示。用ELISA抗体亚类检测试剂盒，检测3株杂交瘤的腹水，单抗亚类均为IgG1。

2.3间接过氧化物酶染色结果经过纯化的McAb，以不同的稀释度对甲醛固定的细胞片进行间接过氧化物酶染色，结果如图2所示(抗体浓度为0.2 μg/ml)。细胞膜高表达P185的T6-17细胞为膜阳性染色，而无P185表达的NIH/3T3细胞为膜阴性。

2.4免疫荧光染色结果流式细胞术分析这3株杂交瘤上清的免疫荧光染色特性表明它们均与膜高表达P185的T6-17细胞染色，而不与NIH/3T3细胞结合。图3所示为A18单抗流式分析图，A21和A22与A18结果相同(未显示)，这与目前国际公认的标准P185单抗4D5染色效果相同。

1腹水及各步纯化抗体SDS-PAGE电泳图

Fig.1Diagram of SDS-PAGE analysis of mo