摘要目的：通过原核表达系统获得研制ZP疫苗的靶抗原。方法：用PCR方法删除猪卵透明带-3α（pZP3α）cDNA 5'端非编码区碱基顺序。在扩增的该基因5'端小片段与双酶切3'端大片段在ApaI 位点相连后，通过双酶切位点将读框完整的目的基因定向插入pBV221表达质粒P_RP_L启动子下游的多克隆区。结果： 此重组表达质粒转化宿主菌后经热诱导培养，可在SDS-PAGE胶上观察到61 kD的特异蛋白表达条带，而且它在Western blot 鉴定实验中能被抗pZP IgGs识别。结论：非糖基化天然pZP3α蛋白的可获得性将有助于研制和评价基于pZP3α蛋白的避孕疫苗。

中国图书分类号 R392. 11

Study on the expression of porcine zona pellucida (ZP)-3α in a prokaryotic system

XU Wan-Xiang, QIU De-Yi, JIA Xiao-Ming et al

（Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032）

AbstractObjective:To provide the target antigen for the development of a ZP vaccine by using a prokaryotic expression system. Methods:To obtain non-fusion expression, the fragment (249 bp) from ATG to Apa Isite of pZP3α cDNA, which was deleted the 5'-terminus non-coding region, was amplified by PCR. The amplified sequenced EcoRI- Apa α fragment was ligased with the 3'-terminus Apa I -IαSal I fragment of pZP3α cDNA from pZ58 plasmid, and then the reconstructed pZP3α with a complete open reading frame was inserted in frame downstream of the P_RP_L promoter in a pBV221 vector. Results:After transformation of E.coli BL21 (DE3) and thermo-induction, the pZP3α protein with 61 kD was expressed at the level of more than 10% of the total cellular proteins and the specific protein band on SDS-PAGE gel could be recognized by anti-porcine ZP IgGs in Western blotting. Conclusion: The availability of native and non-glycosylated pZP3α protein will help in the development and evaluation of a contraceptive vaccine based on pZP3α protein.

Key wordsPorcine ZP3αE.coliGene expression

哺乳动物卵透明带（ZP）一直被看作抗受精避孕疫苗的潜在靶抗原，也是生殖生物学界研究精卵识别、结合和穿透等事件以及精子顶体反应的重要材料^［1，2］。但由于一般不易分离纯化天然的ZP，特别是它的3种酸性糖蛋白组分，因而阻碍了ZP避孕疫苗研制的进程，包括对精卵受精机制相关细节的深入阐明。随着近年来各物种ZP组分的3个cDNA相继克隆，试图通过基因工程大量获得所需要的ZP蛋白组分也成了ZP研究的一个热点。先前我们已报道了pZP3α cDNA 以融合蛋白形式在大肠杆菌中表达的研究^［3］。鉴于截短 β-半乳糖苷酶，故本研究改而采用非糖基化pZP3α融合蛋白的分子量（约102 kD）较大，表达量未达到所期待的水平，pZP3α蛋白的直接表达途径。

1材料与方法

1.1质粒和菌株pBluescript KS (pBS) 质粒为测序载体，E. coli BL21(DE3)为质粒转化受体菌。P_RP_L启动子表达载体pBV220为预防医学科学院病毒所张智清教授构建。PBV220的衍生质粒pBV221由中科院发育所孙方臻博士惠赠。含全长pZP3α cDNA 的pZ58质粒（pBS/pZP3α）由美国Zonagen Inc. Harris博士馈赠。

1.2试剂和酶EcoRI、ApaI和SalI限制性内切酶以及T4 DNA 连接酶购自Boeringer Mannheim公司，Taq DNA聚合酶购自上海复日公司，核酸和蛋白质分子量标准以及羊抗兔IgG/HRP购自华美生物工程公司。其它生化试剂均为国产分析纯。

1.3兔抗猪ZP IgGs制备见文献［3,4］。

1.4PCR扩增根据发表的pZP3α cDNA序列及PCR引物设计原则，设计一对PCR引物^［5］。上游引物P1：5'-GGGAATTCATGTGGTTGCGGCCGTCC-3' (ATG前引入EcoRI位点)；下游引物P2：5'-CTCCCATGGAGCTGCCTGGG-3' (3'端后紧接ApaI位点)，以pZ58质粒为模板进行PCR扩增，反应参数如下：94℃，1 min;55 ℃, 40 s; 72 ℃, 30 s, 共25轮循环。

1.5PCR产物的DNA测序鉴定PCR 产物（271 bp）经EcoRI和ApaI双酶切的片段(pZP3α', 249 bp)被定向插入pBS测序载体。依据蓝白斑筛选的重组克隆被扩增培养后用DNA纯化盒提取pBS/pZP3α'质粒, 在ABI373A型DNA测序仪上进行生物素荧光标记DNA序列自动分析。

1.6删除5'端非编码区的pZP3α^* cDNA 以及pBV220- pZP3α^*和pBV221- pZP3α^*重组表达质粒的构建删除5'端非编码区的pZP3α' （EcoRI-ApaI）小片段与双酶切自pZ58质粒的pZP3α" （ApaI-SalI）大片段(1 445 bp, 含原cDNA 3'端EcoRI位点与pBS多克隆区SalI位点之间的27 bp)在ApaI位点相连，然后将此读框完整的新的pZP3α^* cDNA(1 694 bp) 定向重组插入pBV表达质粒。酶切、片段回收、连接、转化、质粒提取和电泳鉴定等操作均参照文献［6］或相应试剂盒说明书进行。

1.7工程菌BL21/pBV221- pZP3α^*的热诱导表达经转化构建成BL21(DE3)/pBV221- pZP3α^*工程菌后，挑其单菌落接种于加入氨苄青霉素（Ap）的3 ml LB培养液，于30C振荡培养过夜，翌日晨以1/50 （V/V）的比例转接入加Ap的50 ml LB 培养液，于30C继续培养2～3 h, 待菌液的A₆₀₀吸光度达到0.7左右时升温至42 ℃ ，振荡培养4 h后收集菌体。

1.8猪ZP3α蛋白表达产物的SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定见文献［3-6］。

2结果

2.1pZP3α cDNA 5'端非编码区的删除通过原核生物直接表达目的蛋白，存在表达载体上的SD序列与目的基因ATG之间距离的限制。选用PCR方法删除pZP3α cDNA 5'端的非编码碱基（33 bp）。由于目的基因长1 700 bp^［3,5］, 所以为防止PCR过程中可能产生的碱基突变，仅扩增了该基因读框起始密码ATG到前部ApaI单一酶切位点的短片段（271 bp），经双酶切后此EcoRI-ApaI片段（pZP3α', 249 bp）被定向插入pBS质粒进行DNA测序分析（图1）。酶切鉴定结果见图2。然后酶切纯化来自pBS-pZP3α'质粒的EcoRI-ApaI pZP3α' 短片段以及来自pZ58质粒中pZP3α cDNA 3'端的ApaI-SalI长片段（pZP3α", 1 445 bp），通过DNA连接酶在ApaI位点使之相连接，最终构建成删除了原克隆基因5'端大部分非编码碱基的pZP3α^* cDNA。

图1pZP3α基因5'端PCR片段的DNA测序图谱

Fig.1Sequencing result for the PCR product of pZP3α cDNA

Note:"↑" and "↓", indicate the sequenced PCR fragment from EcoRI to ApaI site

图2PCR片段的5％聚丙烯酰胺凝胶电泳

Fig.25% PAGE analysis of the PCR fragment

Note：1. 100 bp ladder；2. The PCR fragment digested by EcoRI and ApaI；

3. The PCR fragment from pBV221- pZP3α after digestion by EcoRI-ApaI；

4. The ψ x 174/Hae III marker

2.2pBV220- pZP3α^* 和pBV221-pZP3α^*重组表达质粒的构建经琼脂糖凝胶电泳回收的具有EcoRI和SalI粘性末端的pZP3α'-pZP3α连接片段 pZP3α^*，在DNA连接酶的作用下，被定向重组插入pBV220和pBV221表达载体P_RP_L启动子下游多克隆区的EcoRI和SalI位点。连接反应液转化大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌后，在加入氨苄青霉素(Ap)的LB固体平板上挑选若干单菌落进行扩增培养，最后借助DNA纯化试剂盒抽提重组质粒进行酶切鉴定（图3），从而确定BL21(DE3)/pBV220- pZP3α*和BL21(DE3)/pBV221- pZP3α^*工程菌。

图3重组质粒pBV221- pZP3α的酶切鉴定

Fig.31.2% agarose gel analysis of restricted fragments from pBV221-pZP3α^* recombinant plasmid

Note:1.λ DNA /EcoRI+HidIII marker；2. pBV221-pZP3α^* digested by EcoRI+ApaI；

3. pBV221-pZP3α^*digested by EcoRI；4. pBV221-pZP3α digested by SalI；

5. pBV221 digested by EcoRI；6. PBS/ pZP3α (pZ58) digested b