摘要目的：测定抗重组人α2a-干扰素单克隆抗体的抗原识别表位及其亲和常数。方法：借助于生物传感器技术进行抗原抗体相互作用的动力学分析。结果：抗体的亲和常数介于10^-5～10^-7之间，5株抗体识别干扰素分子上4种不同的抗原表位。结论：生物传感器在研究抗原抗体相互作用中确为一个理想的工具，适合于抗原抗体结合与解离的动力学分析及预测表位的构像关系。

中国图书分类号R392.11

Determination of affinity and antigenic epitopes of recombinant human interferon-α2a with monoclonal antibodies by biosensor

ZHU Yong，JIN Bo-Quan，LIU Xue-Song

（Department of Immunology,Fourth Military Medical University,Xi'an 710032）

AbstractObjective:To determine the affinity of 5 monoclonal antibodies specific for recombinant human interferon-α2a and antigenic epitopes of interferon.Methods:The affinity constants were measured by means of kinetic analysis,and the antigenic epitopes were determined subsequently,via the biosensor technique.Results:It was shown that the affinity constants of the antibodies ranged from 10^-5 to 10^-7 and the antigenic epitopes could be categorized into 4 groups.Conclusion:Based on the results obtained,it was concluded that the bisensor is a very ideal and powerful tool to facilitate the kinetic analysis of interaction between antigen and antibody and for prediction of conformational distribution of antigenic epitopes.

Key wordsBiosensorMonoclonal antibodyKinetic analysisEpitope mapping

生物传感器(biosensor)是一种实时监测生物大分子之间相互作用的新技术和新设备。借助于这一技术，可以动态观察抗原抗体之间结合与解离的平衡关系，较为准确地测定抗体的亲和力及识别抗原表位，帮助人们了解单克隆抗体特性，从而有目的地筛选各种具有最佳应用潜力的单抗，而且较常规方法省时、省力，结果也更为客观可信，它在国外生物医学研究方面已有较广泛的应用，但在我国才刚刚起步。最近我们采用Affinity Sensors公司生产的生物传感器IAsys Plus对本室制备的5株抗重组人α2a-干扰素(recombinant human interferon-α2a，rHuIFN-α2a)单克隆抗体的抗原识别表位及其亲和常数进行了测定。结果表明生物传感器在抗原抗体结合的动力学分析方面确有其独到之处。

1材料与方法

1.1rHuIFN-α2a及其单克隆抗体的制备抗rHuIFN-α2a单克隆抗体杂交瘤由本室制备^［1］。常规制备单抗腹水，经40%硫酸铵盐析和DEAE-FPLC纯化，纯度达90%。rHuIFN-α2a粗品由海南新大洲药业有限公司提供，采用本室研制的亲和层析柱^［2］进一步纯化，纯度为90%以上。

1.2rHuIFN-α2a包被样品池(cuvette)羧甲基葡聚糖(carboxymethyl dextran,CMD)预处理的样品池由Affinity System 公司惠赠，按照产品手册及提供的NHS/EDC kit活化CMD上的羧基后，分别在两个样品池中加入rHuIFN-α2a(50 μg/ml)和牛血清白蛋白(BAS，100 μg/ml)各50 μl，5 min后用乙醇胺封闭空余羧基3 min。然后用1 mol/L甲酸洗去游离及非特异结合之蛋白分子。

1.3生物传感器工作的原理和基本过程简言之，生物传感器的工作原理是利用表面等离子共振(surface plasmon resonance)现象监测传感片表面介质的折射率变化所引发的共振角改变，而这一改变与传感片表面结合的生物大分子的量成正比，溶液中游离的分子不影响共振角的大小，因此非常特异、敏感。用生物传感器检测任何生物大分子间的相互作用都要经过这样几个步骤：结合-解离-再生(图1)。以本实验中rHuIFN-α2a与单抗相互作用为例，首先将包被好rHuIFN-α2a的样品池放入生物传感器，平衡10 min，①基线(baseline):加入 pH7.2，0.01 mol/L PBS 50 μl，等待5 min，作一平稳基线。②结合(association):吸去PBS，加入45 μl PBS和5 μl单抗，待单抗结合至饱和时吸去单抗液。③解离(dissociation)：换50 μl PBS，待单抗结合与解离达到平衡。④再生(regeneration):换20 mmol/L HCl 50 μl作用2 min以完全洗脱结合的单抗。⑤回复基线：换PBS,再次回到基线，即可开始下1个循环。

图1生物传感器检测生物大分子间相互作用的基本过程

Fig.1Typical working cycle of a biosensor

Note:b.baseline a.association d.dissociation r.regeneration

1.4抗原抗体结合的动力学分析如1.3所述，将每种单抗用PBS稀释为5个不同浓度，依次分别测定各浓度单抗与包被抗原结合、解离速率，并通过随机附送之专用软件FASTfit计算各株单抗的亲和常数。

1.5抗原识别表位测定在抗原抗体结合动力学分析的基础上，将每株单抗均稀释为中等饱和结合浓度，两两配对，首先在平衡好的样品池中加入Ab1，经结合、解离后，换Ab2，继续结合、解离过程。再生后进行下1个循环，将Ab1和Ab2作用顺序调换，重复进行上述步骤。

2结果

2.1pH5.0条件下rHuIFN-α2a包被量最大经试用pH3.0～6.0四种不同pH值、10 mmol/L的乙酸钠缓冲液进行预包被，发现pH5.0包被缓冲液最利于rHuIFN-α2a与CMD样品池的偶联。生物传感器测定值为379.45 acr seconds,相当于样品池每mm²表面包被了1.90 ng rHuIFN-α2a。

2.25株单克隆抗体的亲和力及其结合、解离特点图2显示了单抗3F1在5种不同浓度(2.88×10^-7、2.88×10^-6、1.15×10^-5、5.75×10^-7和1.15×10^-6 mol/L)时结合与解离的动态变化。从所得动态曲线采集数据，经FASTfit分析计算，5株单抗的亲和常数分别为1B8：1.76×10⁵ mol/L、2B6：4.88×10⁶ mol/L、3F1：6.95×10⁶ mol/L、4G5：1.15×10⁵ mol/L、5G10：4.64×10⁶ mol/L。同时结果显示5株单抗均不与BSA结合，表明该系统特异性良好，结果可靠。

图2单克隆抗体3F1与rHuIFN-α2a相互作用的动力学分析

Fig.2Kinetic analysis of interaction between rHuIFN-α2a

and monoclonal antibody 3F1

Note:peridium IFN-α2aperidium BSA

2.3rHuIFN-α2a分子上抗原表位至少有4种图3显示了单抗1B8、2B6和3F1两两配对时，用生物传感器测定它们识别rHuIFN-α2a抗原表位的情形。图4为5株单抗两两配对时的相互拮抗关系，0表示第二抗体的结合完全被阻断，提示第一和第二抗体识别表位相同或相近；+表示第二抗体仍可结合，提示第一和第二抗体识别表位不同。值得注意的是，有一些抗体两两配对时的结合顺序不同，出现的结果也不同。如单抗2B6不能阻断单抗5G10与抗原的结合；而反过来5G10可完全阻断2B6与抗原的结合。这种情形提示这两株单抗识别的抗原表位不同，但相距较近。在构像关系上，2B6识别表位可能位于抗原分子折叠的凹陷处，5G10识别表位位于其上方。根据Venndiagram作图，得到图5所示的抗原表位识别图谱。可以清楚地看出，5株单抗识别rHuIFN-α2a分子上至少4种表位，其中1B8和2B6为一组，3F1、4G5和5G10各自独立为一组。

图3rHuIFN-α2a分子上抗原识别表位的测定

Fig.3Antigenic epitope mapping of rHuIFN-α2a

Note:1.mAb-1B8 2.mAb-2B6 3.mAb-3F1

图4生物传感器对单抗识别rHuIFN-α2a表位配对测定

Fig.4Pairwise antigenic epitope mapping of rHuIFN-α2a by biosensor

图5rHuIFN-α2a分子上抗原表位图谱

Fig.5Venn diagram representing antigenic epitope map of rHuIFN-α2a

3讨论

生物传感器的应用范围十分广泛，除了抗原-抗体以外，还可以进行配体-受体^［3］、核酸-核酸、核酸-蛋白^［4］、细胞^［5］、噬菌体