摘要目的：研究INF-α在类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocyte,FLS)信号转导中MAPKs激活情况。方法：原代培养类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞；应用Western blot检测TNF-α短时间内引起RA FLS蛋白质酪氨酸磷酸化状态变化，及其对MAPKs家族成员活化的浓度效应和时相特点。结果：INF-α可以瞬时引起RA FLS 蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加；并在短时间内激活MAPKs通路(ERK₂、JNK₂、P₃₈为主)，不同浓度梯度TNF-α作用显示：10 U/ml时对ERK₂、JNK₂即可达到峰值活化，100 U/ml时P₃₈达到最大活化。时间上，ERK₂、JNK₂、P₃₈的活化分别在TNF-α作用后5 min、15 min、15 min最明显。结论：INF-α在RA FLS 信号转导中，可以瞬时导致蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加，并同时激活MAPKs 3条通路，但是MAPKs 3个亚家族成员的活化具有异质性。

中国图书分类号R593.22

Activation of MAPKs in signal transduction of TNF-α in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

SUN Tie-Zheng,L Hou-Shan,YAO Li-Bo et al

（Arthritis Clinic and Research Center,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100044）

AbstractObjective:To study on MAPKs activation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA FLS) under the stimulation of TNF-α.Methods:RA FLS were primarily cultured;Western blot was applied to examine transient change of protein tyrosine phosphoralation status and MAPKs activation in RA FLS stimulated with various doses and periods of TNF-α.Results:TNF-α transiently increased protein tyrosine phosphoralation,and activated MAPKs cascades(mainly ERK₂,JNK₂,P₃₈) in RA FLS.The peak activation of ERK₂ and JNK were abstained at 10 U/ml,but that of P₃₈ was at 100 U/ml.The maximal activations of ERK₂,JNK₂ and P₃₈ took place at 5 min、15 min and 15 min respectively after stimulation with TNF-α.Conclusion:During signal transduction of TNF-α in RA FLS,tyrosine phoshorylation were increased transiently,MAPKs cascades were activated in a few minutes and there was heterogenicity of activation among three subfamily members.

Key wordsArthritisFibroblastsSignal transductionTNF-alphaMapk

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种由细胞因子介导的慢性疾病，以滑膜组织炎性增生，关节进行性破坏为特征。在类风湿关节炎的病情进展中，TNF-α在促进成纤维样滑膜细胞功能活化并导致关节炎性破坏过程中发挥重要作用：TNF-α可以诱导IL-1、IL-6的产生，促进胶原酶、MMP、PGE₂的合成，增强粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达等^［1］。另外，TNF-α的转基因小鼠出现多关节炎性改变^［2］。然而，TNF-α在类风湿关节炎中滑膜成纤维细胞中引发上述改变的信号转导机制尚不明了。TNFR不具备任何激酶活性，但是它却可以引起许多细胞靶蛋白分子的快速磷酸化^［3］。我们通过应用TNF-α作用于RA FLS观察TNF-α信号转导过程中MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)通路的激活情况。

1材料与方法

1.1滑膜细胞的培养滑膜均取材于北京医科大学人民医院骨关节诊疗研究中心行膝关节置换或滑膜切除术的类风湿关节炎病人，所有病人均符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准^［4］。术中取出滑膜组织，立即于无菌条件下剪碎，1.0 mg/ml I型胶原酶(Gibco-BRL)37℃消化4 h，离心收集细胞，加入20%FBS-DMEM(Gibco-BRL)培养液，置于37℃、5%CO₂孵箱中令其贴壁生长，细胞生长至85%汇满时，胰蛋白酶-EDTA消化进行1：3传代。本实验中采用3～5代滑膜成纤维细胞，型别均一，纯度可达98%(CD₃、CD₁₄、CD₂₀、CD_11b、Von willibrand factor阳性细胞比例均小于1%)。

1.2细胞因子作用和蛋白提取与定量将同一来源的3～5代滑膜成纤维样细胞5×10⁵种于60 mm平皿(Costar)中，生长至85%汇满时，弃去培养液，换用含0.3%BSA或1%小牛血清的DMEM培养液静息24 h，分别加入TNF-α不同浓度梯度(1、10、100 U/ml)作用5 min，10 U/ml TNF-α作用不同时间(1 min、2 min、5 min、15 min)，预冷PBS冲洗细胞，立即加入100 μl细胞裂解液［20 mmol/L Tris/Cl (pH 8.0),1%(v/v) NP-40，150 mmol/L NaCl,0.1%(v/w)NaN₃,5 μg/ml aprotinin,1 mmol/L PMSF,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L Na₃VO₄,25 μmol/L PNP',1 μmol/L pepstatin A,1 μmol/L leupeptin］,刮下细胞，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，-70℃冻存。电泳前采用Bio-Rad DC Protein Assay进行总蛋白浓度测定，保证每孔上样量的一致性。

1.3SDS-PAGE蛋白电泳和Western印迹杂交取上述30 μg细胞裂解提取物，加入5×上样缓冲液［250 mmol/L Tris/Cl(pH 6.8),500 mmol/L DTT,100 mg/ml SDS,20%甘油，少量溴酚兰］，进行10%SDS-PAGE电泳，半干转移至硝酸纤维素膜(Gelman)，5%奶粉封闭过夜，分加入抗磷酸化酪氨酸单克隆抗体(4G10)1：2 000 (Promega),抗活化形式ERK抗体1：2 000 (Promega)，抗活化形式 JNK抗体1：2 000 (Promega)，抗活化形式P38抗体1：2 000 (Promega)，室温杂交3 h，PBS-Tweern 20洗膜5 min×3次，HRP标记的相应二抗作用2 h，洗膜后ECL化学发光(Amersham),Kodak X 片曝光，显像。将上述硝酸纤维素膜4℃湿化状态下封闭保存，1 w内将膜上抗体洗脱，50℃作用30 min，重新封闭，分别加入非活化形式ERK、JNK、P₃₈抗体(Promega)，之后加入HRP标记相应二抗，ECL化学增强发光，Kodak X片曝光显像。作为衡量蛋白上样量一致性的内参照。

2结果

应用特异性抗酪氨酸磷酸化抗体(4G10)进行Western Blot显示，TNF-α可以在短时间内导致RA FLS蛋白酪氨酸残基磷酸化程度增加，见图1，其中以110、97、80、75、65、54、46、42、38 kD等蛋白条带最为明显。在1～15 min时间内，110、97、80、75、65、54、38 kD蛋白磷酸化逐渐增强，42 kD蛋白于5 min磷酸化程度最高，以后逐渐减弱。因为MAPKs 3个亚家族成员的活化形式均发生Tyr-Xaa-Thr双重位点磷酸化，所以我们推测TNF-α导致P₅₄、P₄₆、P₄₂、P₃₈酪氨酸磷酸化极可能即为MAPKs家族中的JNK₂、JNK₁、ERK₂、P₃₈，为求进一步验证，我们采用抗活化形式MAPKs的抗体进行Western Blot，检测TNF-α刺激下MAPKs家族成员活化的浓度效应及其时相特点。TNF-α可以激活ERK，但是以ERK₂、(P₄₂)为主，而对于ERK₁(P₄₄)活化作用较弱。其中不同浓度TNF-α(1、10、100 U/ml)作用于RA FLS，10 U/ml时对于ERK₂即可以达到最大活化，10 U/ml TNF-α刺激不同时间显示5 min时ERK₂活化最明显(见图2)。TNF-α对JNK的激活以JNK₂(P₅₄)为主，对JNK₂(P₄₆)的活化较弱，而且10 U/ml即达活化峰值，但是时间上1～15 min内JNK的活化逐渐增强(见图3)；TNF-α对于P₃₈活化在100 U/ml时达到最大活化，且在1～15 min内逐渐增强(见图4)。以上实验结果重复3次，各图所示为其中一次代表。上述硝酸纤维素膜洗脱后，以非活化形式MAPKs重新杂交显示，各条带密度无明显区别(见图5)，从而证实各孔上样量的一致性，并且说明如上结果反映TNF-α作用下RA FLS中MAPKs家族成员活化状态的差异。

图1TNF-α(10 U/ml)对于RA FLS酪氨酸磷酸化状态的瞬时影响抑制作用

Fig.1Transient effect of TNF-α(10 U/ml) on protein tyrosine phosphorylation in RA FLS

Note:1.T_{0 min};2.T_{1 min};3.T_{5 min};4.T_{15 min};5.T_{15 min}

图2不同浓度梯度、时间梯度的TNF-α对于RA FLS ERK活化的影响

Fig.2ERK activation induced by TNF-α with different concentrations and different time in RA FLS

Note:a.Different concentrations of TNF-α:1.T_{0 U/ml}, 2.T_{1 U/ml},3.T_{10 U/ml},

4.T_{50 U/ml},5.T_{100 U/ml};b.Different time of TNF-α:1.T_{15 min},2.T_{5 min},