摘要目的：用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库。方法：用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠，取其脾细胞，RT-PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体，构建scFv文库，并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性。用KGla作为固相抗原，进行四轮吸附-洗脱-富集的筛选，SDS-PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达。结果：文库的库容为3×10⁶cfu，单个克隆的BstN1 Ⅰ酶切图谱显示多样，提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要，筛选后的文库能很好地表达外源scFv。结论：文库的构建为进一步地分离KGla细胞表面分子抗体基因提供了必要而可靠的基础。

中国图书分类号R392.11

The construction and expression of phage display scFv library from the spleen cells of mice immunized with KGla cells

SUI Jian-Hua, SONG Zeng-Xuan,SHE Ming et al

（Institute of Hematolgy, Chinese Academy of Medical Science & Reking Union Medical College, Tianjin 300020）

AbstractObjective:To construct a scFv library by phage display technique from the spleen cells of mice immunized with KGla cells. Methods: Three mice were immunized with KGla cells, and their spleen cells were harvested. The genes of VH and Vκ were amplified by RT-PCR and a scFv-phage display antibody library was constructed with the amplified V gene. The library was selected by using the KGla cells as panning antigen by 4 rounds of binding-elution-enrichment procedure, and the expression of the library were examined by SDS-PAGE. Results: We were able to produce a scFv library containing 3×10⁶individual clones which showed different patterns after digested with restriction endonuclease BstN I. It indicated that the capacity and diversity of the library is sufficient for screening specific scFv.The surface display expression of the library was also verified. Conclusion: A scFv library of anti-KGla cell surface molecules has been constructed. It will be useful for isolating specific scFv against the cell surface molecules of hematopoietic progenitors.

Key wordsKGlaPhage displayAntibody libraryscFv

单链抗体(single chain antibody, scFv)是抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)由一个连接肽首尾相连组成的单一肽链，具有分子量小、组织穿透力强、体内清除快、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等优点。噬菌体展示抗体库技术是继杂交瘤技术之后抗体技术发展的又一新的里程碑^［1］。该技术是将抗体可变区基因与单链丝状噬菌体衣壳蛋白基因融合，使scFv或Fab段可随衣壳蛋白一起呈示表达于噬菌体的表面，通过简便的吸附-洗脱-富集的筛选过程，而分离获得特异性抗体可变区基因的新技术。人髓系白血病细胞系KGla细胞表面具有造血细胞发育、分化早期阶段相关的多种标志分子，分离这些细胞表面分子的特异性抗体基因具有重要意义。本文报道从KGla细胞免疫小鼠的脾细胞建立scFv噬菌体展示文库，为进一步获得抗造血细胞表面分子的抗体奠定必要的基础。

1材料与方法

1.1小鼠免疫用1×10⁷的人髓系白血病细胞系KGla细胞，腹腔注射免疫3只8周龄的雄性BALB/c小鼠，3次免疫后取脾脏混合，分离脾淋巴细胞。

1.2PCR引物设计VH和VL引物，采用简并引物形式，并在5＇ 端加有克隆入载体的酶切位点。5＇ 端引物均位于小鼠抗体可变区的第一骨架区共有序列(FR1)，3＇ 端引物均位于恒定区起始段。引物序列如下：PH1(γ重链VH5＇ 端引物，35 bp)：5＇-GGACTAGTTGAA(G)GTA(C，G，T)CAGCTGCAGCAA(G)TCA(C，G，T)GGA(C)GC-3＇。PH2(γ重链VH3′端引物，38 bp)：5′-CCAGGGGCCAGTGGGAATTCAAGCTTGGGTGTGTCGTTTT-3’PL1(K轻链5＇端引物33 bp)：5＇-CGACGCGTAGATATCGTC(G)CTC(G，T)ACA(C，T)CAA (G)TCA (C，G，T)CCA-3＇。PL2(K轻链Vκ 3＇ 端引物，27 bp)：5＇-GATGGATCCAG(C)TTGGTGCAGCAT(A)CAGC-3＇。

1.3载体、菌株及主要材料与试剂噬菌粒pSEX81和pSEX81-PHOX由德国海德堡大学Dübel博士惠赠。大肠杆菌XL1-Blue和辅助噬菌体M13KO7为本室保存。Taq DNA 聚合酶购自Boehringer Mannheim公司；T4 DNA ligase，限制性内切酶dNTP，逆转录酶(M-MLV)等均购自GLBCO/BRL公司。电穿孔仪为Bio-RAD E.Coli Pulser；PCR扩增仪为PE2400型；PEG/NaCl 溶液：20%PEG8000，9%NaCl；SOB、LB、2×YT培养基按《分子克隆》配制，含葡萄糖(Glucose, G)培养基中G浓度均为100 mmol/L；抗生素培养基中氨苄青霉素(Ampicillin,A)为 100 μg/ml，卡那霉素(Kanamycin,K)：50 μg/ml；四环素(Tetracycline，T)：10 μg/ml。其余试剂均为分析纯。

1.4VH及Vκ cDNA的克隆RNA的提取：从10⁷参照异硫氰酸胍一步法提取总RNA^［2］脾细胞。逆转录PCR(RT-PCR)：以脾细胞总RNA为模板，用PH2和PL2引物，分别逆转录合成VH和Vκ cDNA第一链。逆转录条件：5×第一链缓冲液10 μ1，RNA样品10 μg，M-MLV 2 μ1(200 U)，RNasin 40 U，dNTP 终浓度为 300 μmol/L，引物30 pmo1，加无RNase H₂O至总体积50 μ1，37°C保温1 h。以逆转录产物为模板，PH1/PH2和PL1/PL2为引物，分别PCR扩增全套VH和Vκ基因片段。PCR 反应程序为：97°C预变性2 min，继以94°C变性30 s，60°C退火45 s，72°C延伸1 min，共30个循环。取5 μ1 PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.5scFv文库的构建

1.5.1Vκ亚文库的构建BamHI和Mlul双酶切经低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化的VκPCR产物，回收此酶切产物后与经同样酶切和纯化的载体pSEX81片段连接，电穿孔转化XL1-Blue，SOBGA培养板扩增转化的细菌(30°C过夜培养)，提取质粒得到轻链亚文库(pSEX81-Vκ)。

1.5.2将VH克隆入pSEX81-Vκ亚文库，获得完整的scFv文库将HindⅢ和PvuII双酶切的VHPCR产物和经同样酶切反应的pSEX81-Vk质粒DNA连接，电转化XL1-Blue，取少部分转化细菌铺LBGA平板，计数菌落，测定库容后，其余同上述方法扩增得到完整的噬菌体scFv文库，甘油保存备用。取一部分悬于10 ml 2×YTGA培养基中使OD₆₀₀＝0.8，加入8×10¹¹pfu(感染复数moi为20)的M13KO7，37°C温育90 min，离心沉淀感染的细胞并重悬于15 ml 2×YTAKT中37°C培养5～8 h，离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌体，冰浴至少30 min后，10 000 r/min 4°C离心20 min，以2 ml含1%BSA的PBS重悬沉淀，13 000 r/min离心5 min收集上清即为噬菌体scFv表达展示文库。

1.6scFv展示文库的初步鉴定

1.6.1滴度测定将10 μl经适当稀释的噬菌体scFv文库与100 μl的XL1-Blue菌(OD₆₀₀＝1)室温放置15 min后铺LBGA培养板，37°C过夜，计数菌落，计算菌落形成单位(cfu)。

1.6.2多样性分析随机挑取文库单个克隆提取质粒后进行BstN1酶切消化，分析酶切图谱。

1.7用KGla筛选噬菌体展示scFv文库取PBS洗涤的3×10⁶KGla细胞，含2%BSA的PBS冰浴90 min，沉淀细胞后，用scFv文库噬菌体上清(滴度约2×10¹¹)重悬细胞，4°C轻摇2 h，PBS洗5次后加入500 μ1洗脱液(0.1 mol/L甘氨酸/HCl，pH＝2.5，含0.1%BSA)，冰浴5 min后沉淀细胞，立即加入20 μ1 1 mol/L的Tris中和，加入10 ml OD₆₀₀＝0.8的XL1-Blue 37°C静置1 h，离心后1 ml SOBGA重悬细胞沉淀，全部铺于SOBGA培养板。再按1.5.2的程序进行辅助噬菌体感染和PEG沉淀，所得经KGla细胞筛选后的噬菌体抗体库再进行下一轮的筛选，同样方法筛选4轮。

1.8随机挑选单个克隆进行KGla细胞筛选后次级库的检验限制性内切酶分析和PCR扩增鉴定scFv的重组率。同1.5.2方法用辅助噬菌体超感染制备噬菌体抗体上清，经PEG/NaCl沉淀、重溶后，还原条件下行SDS-PAGE，以M13KO7为阴性对照，携带并能展示抗PHOX scFv的pSEX81-PHOX为阳性对照，噬菌体的上样量为10^13～14pfu，电泳后硝酸银染色。

2结果

2.1噬菌体scFv文库的构建和鉴定RT-PCR扩增获得大小分别为399和357 bp的VH和Vκ基因(图1)，先后克隆到噬菌粒载体pSEX81相应的酶切位点中(图2)，电穿孔转化XL1-Blue细菌，库容为3×10⁶cfu。M13KO7超感染得到噬菌体展示scFv文库，经测定所获文库滴度为10¹²cfu。随机挑取文库的多个单克隆进行BstN1酶切消化，结果呈现多样的酶切图谱(图3)。

图1VH和Vκ的PT-PCR扩增产物

Fig.1RT-PCR amplification of VH and Vκ gene

Note: