摘要目的：探讨淫羊藿甙逆转转化生长因子β₂(Transform ing Growth Factor β₂，TGFβ₂)对LAK、CD₃AK细胞的免疫抑制作用及其机制。方法：采用 MTT法,RT-PCR和流式细胞术。结果：淫羊藿甙能逆转受TGFβ₂抑制 的LAK和CD₃AK细 胞的杀伤活性，并能部分恢复受TGFβ₂抑制的LAK细胞表面IL-2Rα表达和CD₃AK细胞 内穿孔素mRNA水平,以及CD₃AK细胞的增殖活性。结论：淫羊藿甙通 过恢复LAK细胞IL-2Rα 表达，提高CD₃AK细胞内穿孔素mRNA水平及促进CD₃AK增殖，逆转TGFβ₂对LAK 、CD₃AK的免疫抑制作用。

中国图书分类号R730.5

Reversal of transforming growth factor β₂ mediated immunosuppression of LAK and CD₃AK by Icarrin

LI Xiao-YanZHANG LingWANG Yun

（Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062）

AbstractObjective:To study the reversal of trans f orming growth factor β₂(TGFβ₂) mediated immunosuppression of LAK and CD₃ AK cells by Icarrin and its mechanisms.Methods:MTT assay, RT-PCR , Flow Cytometry.Results:ICA can reverse TGFβ₂ mediated suppression of the cytotoxic activity of LAK and CD₃AK cells.It can also reve rse TGFβ₂ mediated downregulation of IL-2Rα expression on LAK cells and pe rforin mRNA level in C D 3AK cells.Conclusion:The mechanisms of ICA function is pro bably due to its capability of reversal TGFβ₂- mediated suppression of IL-2 Rα expression on LAK cells and perforin mRNA level in CD₃AK cells.

Key wordsICATransforming growth factor βLAKCD₃ AKPerforin

TGFβ是一类非常强的免疫抑制因子，由多种肿瘤细胞产生，可强烈地抑制T 细胞的增殖及CT L细胞、NK细胞、Mφ细胞，LAK、CD₃AK、TIL细胞的杀伤活性^〔1〕，并与过继 免疫治疗疗效不佳有直接关系，如果能够阻断其免疫抑制作用，将有利于控制肿瘤的发展， 提高肿瘤的治疗效果。淫羊藿甙(Icarrin,ICA)是一种免疫增强剂和抗肿瘤制剂,具有调节免 疫功能,诱导白血病细胞分化、凋亡,逆转实体瘤细胞恶性表型等作用^〔2-4〕 。本文对ICA逆转TGFβ₂的免疫抑制作用及其机制进行研究,以阐明ICA抗癌作用的新机制 。

1材料与方法

1.1主要试剂、细胞株淫羊藿甙(ICA)从朝鲜淫

羊藿中提取,纯度96%以上,性质稳定。rh TGFβ₂购自Sigma公司;rhIL-2购自北京瑞得合通有限公司;CD₃单克隆抗体为本所田志 刚研究员惠赠。FITC-CD₂₅单抗,FITC-CD₁₆单抗,CD₄-FITC,CD₈-PE,C D₃PE -Cy5单抗均为Immunotech公司产品。 TRIzol Reagent购自GIBCO-BRL公司；DEP C,dATP,dTT P,dGTP,dCTP,M-MLV Reverse Transcriptase,Taq DNA Polymerase均购自华美公司。人肺 巨细胞腺癌PG，人髓样白血病K562细胞为本室保存。

1.2PCR扩增引物β-actin正引物序列为5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA3 ，负引物 序列为5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA3，购自北京医科大学病理系，扩增片段为326 bp；穿孔素 正引物序列为5’TGTATGATGGCTGGGG3，负引物序列为5’CCTGTGGTAAGCATGCT3’,片段大小 为523 bp,由赛百盛公司合成。

1.3LAK和CD₃AK细胞的诱导培养及ICA、rhTGFβ₂的处理健康人外 周抗凝血经淋巴 细胞分离液分离PBMC ,调整细胞浓度至1×10⁶ml^-1,加入IL-21 000 U/ml诱导LA K细胞;加IL -2 100 U/ml,CD₃单抗0.1 μg/ml诱导CD₃AK细胞。两诱导系均设①常规诱导对照组； ②25、 50 μg/ml ICA处理组；③rhTGFβ₂ 5、10 ng/ml处理组；④逆转组rhTGFβ₂ 5、10 ng /ml+ICA 50 μg/ml。各诱导处理组细胞置37℃,5%CO₂饱和湿度培养,其中rhTGFβ₂组和 逆转组 均在第3天补加相同浓度的rhTGFβ₂。

1.4MTT法检测ICA逆转TGFβ₂对LAK和CD₃AK细胞杀伤活性的抑制作用 参照文献［5］略加改进。

1.5MTT法检测ICA和TGFβ₂对CD₃AK增殖的影响将各处理组CD₃AK 细 胞1×10⁶ml^-1接种于96孔板中,每孔200 μl,培养至3、4、6 d,MTT法检测增殖活性 。

1.6流式细胞术检测ICA逆转TGFβ₂对LAK细胞IL-2Rα表达的抑制作用 收集培养至3 d 的LAK各处理组细胞,分别加100 μl 1∶10稀释的FITC-CD₂₅单抗，避光作用0.5 h ，PBS洗1次，上机检测。

1.7RT-PCR法检测ICA逆转TGFβ₂对CD₃AK细胞穿孔素mRNA水平的抑 制作用收集培养 至第4天的各处理组CD₃AK细胞,RNA提取按TRIzol Reagent说明书操作，逆转录和PCR扩增 参照文献〔6〕。

1.8RT-PCR产物定量Gel Dos1000凝胶图像分析仪扫描底片各带,以β- actin为内参照,测定穿孔素基因mRNA相对表达量。

1.9统计处理t检验、χ²检验。

2结果

2.1ICA逆转TGFβ₂对LAK细胞杀伤活性的抑制作用如图1、2所示，IC A 50 μg/ml不仅提高不同效靶比的LAK杀伤和NK样杀伤活性，并且阻断rh TGFβ₂的抑制作用,将受抑的LAK杀伤活性和NK样杀伤活性恢复至正常水平。

2.2ICA逆转TGFβ₂对CD₃AK细胞杀伤活性的抑制作用

2.2.1CD₃AK细胞表型分析结果诱导至第4天的CD₃AK细胞表型为CD ＋ 362.19%,CD^＋₄25.77%,CD⁺₈36.94%,CD⁺₁₆32.25%,CD⁺₂₅17.51% ,表明 CD₃AK细胞是以T细胞为主的异质性细胞群，CD₈⁺细胞所占比例较高。

2.2.2ICA逆转TGFβ₂对CD₃AK细胞杀伤活性的抑制作用如图3所示，ICA不仅可在一定程度上提高CD₃AK的杀伤活性，并逆转rhTGFβ₂对CD ₃AK杀伤活性的抑制作用。

图1培养至第3天的各处理组LAK细胞对PG细胞的杀伤活性

Fig.1The killing activity of control and treated LAK by rhTGFβ₂，

I CA against PG cells

Note:Compared with control，P＜0.05，P＜0.01；compared with rhTGFβ₂ treatment，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0 .01

图2培养至第3天的各处理组LAK细胞对K562 细胞的NK样杀伤活性

Fig.2The killing activity of control and treated LAK cells by ICA,

rhTGF β₂ against K562 cells

Note:Compared with control，P＜0.05，P＜0.01；compared with rhTGFβ₂ treatment，^▲P＜0.05，^▲▲P＜0.01[ ZK)

图3培养至第4天的各处理组CD₃AK 细胞对PG细胞的杀伤活性

Fig.3The killing activity of control and treated CD₃AK cells

by ICA、TGFβ₂ against PG cells

Note:Compared with control，P＜0.05，P＜0.01；compared with rhTGFβ₂ treatment，^▲P＜0.05

表1ICA、rhTGFβ₂处理3 d的IL-2Rα阳性LAK 细胞数的变化

Tab.1Changes of IL-2Rα expression on LAK cells treated by ICA、