摘要目的：构建表达抗人红细胞血型A抗原50A杂交瘤细胞的单链抗 体(ScFv)。方法：应用重组噬菌体抗体技术，从50A杂交瘤细胞中分离 、构建单链抗体基因，并将其克隆入噬粒pCANTAB5E中，转化E.coli XL-Blue，辅助噬菌体 援救构建50A噬菌体单链抗体库；采用完整红细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体，鉴定重 组噬菌体并进行序列测定分析；免疫印迹试验检测重组单链抗体的特异性抗原活性。结果：用M13KO7援救XL-1 Blue转化菌中的pCANTAB5E重组噬菌体，得到滴度 为4×10⁹ pfu/ml噬菌体单链抗体库；免疫印迹试验证实表达产物保留了亲本单抗对人红 细胞血型A抗原的特异性亲和力。结论：成功构建50A McAb单链噬菌体 抗体库，为进一步研制高特异性、高亲和力的基因工程原核血型检定抗体试剂奠定了基础。

中国图书分类号R392.11

Expression of anti-RBC blood group A substance ScFv by using phage display tech nology

WANG Chang-JunTANG Jia-QiLI Xian-Fu

（Institute of Military Medicine, Nanjing Command,Nanjing 210002）

AbstractObjective：To construct a phage-displayed ScFv antibody of 50A hybridoma anti-blood group A substance.Methods:Based on recombinant phage display techniques,the construction,screening and expression of functional single-chain Fv fragment(ScFv) from murine hybrido ma 50A which secrets antibody specifity binding to human blood group A substa nce was performed. By RT-PCR for VH and VL genes assembly of ScFv genes and cl o ning into phagemid pCANTAB5E, transformation of E.coli XL-Blue cells and rescui n g with M13KO7 helper phage. The recombinant phages were panned by whole red bloo d cells over three rounds. Finally, the positive recombinant phages were sequenc ed and identified by immuno-blot assay.Results:A recombinant phage ScFv libra ry with titer of 4×10⁹ pfu/ml was established. The result of immuno-blot in dicated that the phage-displayed 50A-ScFv retained the affinity and specificit y of the original intact antibody to blood group A substance.Conclusi on:Single chain antibody fragment 50A-ScFv displayed on the surface of filamentous phage was successfully produced,which would be potentially useful in constructing engineering antibody fragments as blood grouping reagents.

Key wordsPhage display technologySingle-chain F v antibodyBlood group ABO substance

噬菌体表面呈现技术(Phage display technology,PDT)是利用在改构的噬菌 体 外壳蛋白质基因PIII或PVIII区引入外源基因，以融合形式表达外源肽或蛋白，使其随着 噬 菌体的组装而呈现在噬菌体表面，保持特定的空间构象，并通过免疫亲和吸附法筛选特异性 肽或蛋白的一项新技术^［1］。它的出现极大地推动了抗体工程的发展，为在体外 模拟免疫系统的抗原选择和抗体多样化过程，进而筛选高特异性、高亲和力的基因工程抗体 提 供了技术支持。本实验在已完成杂交瘤建株、分离抗体可变区基因等工作的基础上^{［2 ，3］}，采用噬菌体表面呈现技术，构建了抗人红细胞血型A抗原杂交瘤50A株噬 菌体单链抗体库，为研制第三代基因工程原核血型检定抗体试剂奠定了基础。

1材料与方法

1.1细胞和载体小鼠杂交瘤细胞系50A由本室研制，分泌抗A单克隆抗体 ，为IgM类；E.coli HB2151、E.coli XL-Blue和含(Glu₄Ser)₃接头质粒pSTE-215为 德国Duble教授惠赠；测序用T-Vector easy Kit 购自Promega公司；噬菌体抗体表达载体p CANTAB5E和辅助噬菌体M13KO7购自Pharmacia公司。

1.2工具酶和试剂限制性核酸内切酶为Biolabs产品；T₄ DNA连接酶、 IPTG、碱性磷酸酶为Promega公司产品；PCR Kit为上海Sangon生物工程公司产品；正常人分 离 红细胞由南京军区总医院提供；酶标抗E-tag抗体、鼠抗噬菌体衣壳蛋白抗体为Pharmacia 公 司产品；HRP标记兔抗鼠IgG抗体及DAB显色液为SABC产品。其余试剂均为分析纯级(A、R)或 分子生物学纯级。

1.3PCR引物设计与合成参考已知的小鼠抗体轻、重链可变区氨基酸序列 ，设计合成了抗体可变区5’端及3’端引物。用于扩增重链可变区的一对引物为V_H Back 和V_H For,用于扩增轻链可变区的一对引物为V_L Back和V_LFor，引入连接肽编码基 因用于拼接PCR构建50A单链抗体基因的一对引物为Linker For和Linker Back,用于加端PCR 引入与pCANTAB5E克隆位点SfiI、NotI匹配的一对引物为V_HO和V_LO。引物序列如下：

以上引物由上海Sangon生物工程公司帮助合成纯化。

1.450A单链抗体基因的构建^［3］①V_H和V_L基因克隆：收 集对数生长期杂交瘤细胞，异硫氰酸胍一步法^［4］提取细胞总mRNA，逆转录合成cDN A第一链。用鼠源抗体引物(V_H Back/V_H For,V_LBack/V_LFor)从cDNA中分别PCR扩增 V_H和V_L基因，Microspin柱纯化扩增产物。②连接肽编码基因的克隆：以Linker Fo r和Linker Back为引物，含Linker质粒pSTE-215为模板，常规PCR克隆连接肽编码基因。③ 拼接PCR组装ScFv基因：在75 μl反应体系中，含纯化的V_H、V_L和十五肽接头基因各 20 ng，1.0 mmol/L dNTPs，2.0 mmol/L MgCl₂，5 U Taq DNA多聚酶，混匀后进入拼接 循 环，条件为：95℃变性45 s，62℃退火2.5 min，72℃延伸1 min，共扩增8个循环；在反 应体系中加V_HO和V_LO引物各50 pmol, 5 U Taq DNA多聚酶的混合溶液25 μl，进入二 级 循环：94℃变性50 s，56℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min，共25个循环。拼接PCR反 应后，组装的ScFv基因5’、3’端分别加上与pCANTAB5E载体匹配的NcoI(NcoI与 SfiI具有 相匹配的粘性末端)及NotI酶切位点。

1.5噬菌体单链抗体库的构建将纯化的ScFv片段依次用NcoI/NotI酶切 ，M icrospin柱纯化，在T4 DNA连接酶作用下，定向插入pCANTAB5E表达载体(图1)，常规CaCl 2法转化E.coli XL-1 Blue感受细胞，氨苄抗性丰富培养基培养转化细胞至OD₆₀₀=0. 5，加入 总滴度约3×10⁹pfu M13KO7辅助噬菌体援救，构建噬菌体抗体库，涂板测定抗体库滴度。

1.650A单链抗体的融合表达及纯化转化体1/100转种20 ml含2%葡萄糖及 100 μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养液，于28℃～30℃振荡培养约4 h(OD₆₀₀=0.5) ， 加入总滴度为10⁹ pfu的辅助噬菌体M13KO7，37℃水浴静置15 min。离心收集菌体，以等 体积L B液(无葡萄糖)洗涤2次，重悬于20 ml LBAK(含50 μg/ml卡那霉素及100 μg/ml Amp)液中 30℃培养过夜。培养液4℃ 10 000 r/min离心10 min，收集上清，按每ml上清加入150 μl PA溶液(16% PEG 6000，3.3 mol/L NaCl),4℃静置2 h，4℃ 10 000 r/min离心沉淀纯化噬 菌体。

1.7噬菌体抗体库的亲和吸附及富集^［5］

1.7.1 亲和吸附取10¹²pfu纯化重组噬菌体重悬于2 ml PBS稀释的 正常人A型红细胞悬液(4×10⁷ cell/ml)200 μl,轻柔混匀，4℃水浴30 min。离心去上清 ，红细胞沉淀用15 ml预冷的PBS 4℃洗涤4次，每次15 min。向洗涤红细胞沉淀中加预冷灭 菌去离子水30 μl，轻轻摇匀。此红细胞裂解液含有亲和富集的重组噬菌体。

1.7.2 转染和援救将红细胞裂解液加入到3.0 ml新鲜培养的XL-1 Blue 菌液中(OD₆₀₀=0.5)，37℃静置水浴15 min。取1 μl测定菌斑形成单位(CFU)，其余 菌液37℃振荡培养。同1.6进行援救和纯化，得到第一轮富集后的噬菌体抗 体库，重复1.7.1～1.7.2步骤3次。

图150A单链抗体表达载体pCANTAB5E构建示意图

Fig.1The construction scheme of ScFv expression vector pCANTAB5E

1.8重组噬菌体质粒的鉴定挑取亲和富集后转化体，常规扩大培养，碱 裂解法提取质粒DNA，PEG法纯化质粒，用双酶切法和PCR扩增鉴定重组噬菌体^［6］。

1.950A单链抗体的分泌表达将滴度为1×10⁹ pfu/ml阳性重组噬菌体 转染对数生长期HB2151细胞，铺板后挑单菌落于含1 mmol/L IPTG和100 μg/mg氨苄的2×YT 培养液中，25℃～30℃，培养20 h，离心收集上清。沉淀用PBS悬起，在液氮和37℃水浴中 反复冻