摘要目的：利用酵母真核细胞表达系统表达出重组人内皮抑制素 (Endostatin)，并对其促成纤维细胞有丝分裂活性进行研究。方法：采 用逆转录-PCR技术自人肝组织获得人内皮抑制素的cDNA，将其克隆入真核表达载体pYEX4T -1，构建含人Endostatin的重组质粒(pYEXEndo)；经全自动序列分析仪测序确证后，将此 重 组质粒转化入酵母细胞(DY150)中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析及Western blot 鉴定。以MTT掺入法初步检测了重组人内皮抑制素对NIH3T3细胞的促有丝分裂活性。结果：经CuSO₄诱导的含pYEXEndo的酵母细胞表达出重组人GST-Endostatin 的融合蛋白，此蛋白在凝胶上表现为一约45 kD的阳性区带，在Western blot实验中可被GST 特异性多克隆抗体识别。重组人 GST-Endostatin融合蛋白的粗提物在体外能刺激NIH3T3细 胞增殖。结论：人GST-Endostatin的融合蛋白在酵母表达系统中高水平表达， 并具有刺激成纤维细胞生长的生物学活性。

中国图书分类号R392-33

Expression of recombinant human endostatin in yeast and its mitogenic activity on fibroblast cells

SUN Lu-GuoJIANG YingYU Yong-Li

（Department of Imm un ology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun130021）

AbstractObjective：To express recombinant human endostatin in yeast and study its mitogenic activity on 3T3 fibroblast cells.Methods：Human endostatin cDNA isolated from the liver tissue by using RT-PCR was cloned into pYEX4T-1 expression vector. After identifying the sequence of the insert, the recombinant endostatin was expressed in DY150 ye ast cell and the product was identified by Western blot.MTT was used to assay th e activity of recombinant protein.Results：Recombinant hum an GST-Endostatin fusion protein was expressed in DY150 yeast cells under the i nduction of CuSO₄ and was observed as a hand of 45 kD on a SDS-PAGE gel and b y We stern blot. The recombinant fusion protein was also found to be able to stimulat e proliferation of NIH3T3 cells.Conclusion：Recombinant h u man GST-Endostatin fusion protein was expressed in the yeast in a high level an d showed mitogenic activity on murine fibroblasts.

Key wordsEndostatinYeast expressionMitogenic activity Fibroblast

近年发现的内皮抑制素(Endostatin)是胶原XⅧ的N-末端片段^［1］，对血管形成有明显的抑制作用。O'Rei ll y等已克隆表达出重组鼠Endostatin并将其用于荷多种肿瘤的小鼠。Endostatin几乎对所有 肿瘤均表现出强大的抑瘤活性^［1］，因此Endostatin有可能成为很有前途的抗肿瘤 药 物。我们从人肝脏组织中分离出人Endostatin cDNA，在可高效表达GST融合蛋白的酵母表达 系统中表达出重组人Endostatin蛋白质，并采用小鼠NIH3T3成纤维细胞研究了其促有丝分裂 活性。

1材料与方法

1.1材料TriZOL试剂，购自GIBCO/BRL公司；逆转录酶，RNasin，TaqDNA聚合酶 购自Promega 公司；YEXpressTMYeast表达系统购自美 国CLONTECH Laboratories；INC、pCR^TM Ⅱ质粒购自Invitrogen、OligodT；菌种DH5α，INVαF本室保存；DNA重组所用的各种限制 酶，T4连接酶购自大连宝泰克公司；酶标驴抗兔抗体由本教研室提 供；NIH3T3细胞株由长春吉林大学惠赠；新鲜人肝脏组织来自于白求恩医科大学第一临床医 学院手术标本。

1.2逆转录-PCR用TriZOL试剂盒 从人新鲜肝脏组织中提取总 RN A，以Oligod T为引物将其逆转录为cDNA，再以PCR扩增出目的DNA片段。PCR所用引物是根 据人胶原XVⅢ的cDNA序列^［2］设计而成，上游引物：5'-tatagaa ttcATGCACAGCCACCGCGACTTCC-3'；下游引物：5'-tatcgtcgacCTACTTGGGGCAGTCATG -3'由上海 Sangon公司合成，引物5'端携带有EcoRI及SalI酶切位点。常规PCR反应条件扩增目的cDNA 。

1.3PCR产物的克隆将PCR产物直接克隆入pCR^TMⅡ质 粒，得到pCR^TMⅡ-Endo重组质粒，克隆方法见文献［3］。

1.4重组表达质粒(pYEXEndo)的构建利用人Endostatin cDNA片 段内一偏心酶切位点PstI对目的cDNA片段进行酶切，初步鉴 定 其为Endostatin后，将人Endostatin片段定向次级克隆入pYEX4T-1真核表达质粒EcoRI及Sa lI酶切位点中，克隆方法见文献［4］ ，酶切鉴定筛选出阳性克隆。

1.5序列测定纯化重组质粒pYEXEn do，经宝泰克公司DNA序列自动分析仪进行序列分析。

1.6目的基因的表达依照说明书将pYEXEndo重组质粒转化入DY150酵母 细胞 中，并对阳性重组酵母细胞进行诱导表达，表达产物 按常规方法进行SDS-PAGE。

1.7重组蛋白的Western印迹分析由于重组蛋白为GST融合蛋白， 所以利用抗GST抗体可对重组蛋白做进一步鉴定。转膜及杂交方法见文献［4］。

1.8重组蛋白的促有丝分裂活性测定收集诱导表达的阳性克隆酵母细胞 ，并经超声裂解后，经PBS透析得到GSF Endostatin重组蛋白粗提物，以5×10³/孔接种NI H3T3细胞于96孔板中0.5%血清IMDM培养过夜后，弃培养液，加入不同浓度的粗提表达产物， 继续培养16 h，加入MTT(0.2 mg/ml)，37C放置4 h，弃上清，加MTT溶解液(100 μl/ 孔)，37C温育2 h，测OD值。

2结果

2.1RT-PCR扩增人Endostatin cDNA及初步鉴定以人肝脏组织总RNA为 模板，通过RT-PCR扩增得到PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。人Endostatin cDNA片段长 为549 bp，PCR产物长度与其基本一致。克隆得到pCRTMII-Endo重组质粒后，选择Endostatin cDN A片段内一偏心限制性内切酶酶切位点PstI进一步酶切，电泳后可见cDNA片段被切成大小为1 59和390两段，与报道一致，初步证实其为人Endostatin ，结果见图l。

图1人内皮抑制素cDNA的PCR扩增及鉴定

Fig.1Identification of amplified and digested RT-PCR products

Note:A.PCR product of Endostatin cDNA;l,Endostatin specific cD NA indicated by an arrow;2, DNA marker. B.l, DNA marker;2,pCRTMII-endo EcoRI,Psti; 3,pCRTMII-endo EcoRI

2.2pYEXEndo重组质粒的构建次级克隆将人Endostatin cDNA以Eco RI、SalI位点定向克隆入表达质粒，所得到的重组质粒pYEXEndo经EcoRI、SalI双酶切及2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。重组质粒构建示意图及鉴定结果见图2。

2.3人Endostatin cDNA的序列测定将重组质粒pYEXEndo进行序列分析 ，结果显示插入片段长为549 bp，编码183个氨基酸 。测序结果及所推导的氨基酸序列与文献报道完全一致(见图2C)。

2.4人 Endostatin在酵母细胞中的表达 pYEX₄F₁是一种GST融合蛋白的表达载体，GST的分子量为27 kD，而人内皮抑制素的 分 子量约为20 kD。因此经诱导表达的重组人GST-Endostatin融合蛋白的分子量为47 kD。SDS -PAGE (见图3A)表明，重组人GST-Endostatin融合蛋白在酵母细胞中经诱导得到高效表达，在45 kD 处可见一新生蛋白带，这与预期的蛋白质分子量基本一致，而未诱导组未见有明显的重组蛋 白的表达。

2.5表达的重组蛋白的Western印迹分析利用抗GST的抗体与辣根过氧化 物酶标记的二抗对重组蛋白进行了Western印迹分析。结果(图3)显示：诱导组在大小约45 k D处可见一特异性条带，未诱导组在同样位置也有微弱条带显现，提示重组GST融合蛋白诱导后稳定表达。

图2重组质粒pYEXEndo的构建及人Endostatin cDNA的序列测定

Fig.2Construction of recombinant pYEXEndo plasmid

and sequencing of hu man endostatin cDNA

Note:A.Diagram of recombinant pYEXEndo plasmid construction；B.Analysis of recombinant pYEXEndo plasmid;l, DNA marker;2, pYEXEndo/EcoRI,SalI;C.Original data of human Endostatin cDNA sequencing

2.6重组人Endostatin活性的初步测定采用粗提的方法自酵母细胞中提 取经诱导后表达的重组蛋白，经MTT掺入法检测了其对NIH3T3成纤维细胞的促有丝分裂 的 活性。实验表明：加入重组人Endostatin蛋白孔的NIH3T3成纤维细胞平均OD值明显高于对照 组及阴性对<