摘要目的：构建人肝癌特异的免疫毫微粒，探讨免疫毫微粒体外对 靶细胞的特异性结合特性及杀伤活性。方法：采用异型双功能交联剂SP DP将人肝癌单抗HAb18与载米托蒽醌的白蛋白毫微粒化学偶联，构建人肝癌特异的免疫毫微 粒；采用玻片凝集试验，免疫荧光法及荧光染色阻断法，花环形成实验及花环形成阻断实 验 ，扫描电镜， ³H-TdR掺入试验证明抗体与载药毫微粒偶联及免疫毫微粒能特异性结 合并 杀伤靶细胞SMMC-7721人肝癌株。结果：HAb18抗体已偶联到载药毫微 粒上；免疫毫微粒能良好地与靶细胞特异性结合，对靶细胞具有剂量依赖性、选择性杀伤作 用。结论：SPDP偶联方法能用于构建免疫毫微粒；人肝癌特异免疫毫微 粒体外能特异性结合并杀伤人肝癌细胞株。

中国图书分类号R392.2R730.61

Preparation and immunological characterization of mitoxantrone-loaded immuno-nanoparticles against human hepatoma

LIU Xiao-BoCAI Mei-Ying

（Department of Immunology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041）

AbstractObjective：To construct human hepatoma-specific immunonanoparticles and observe in vitro binding and killing of target cells by the immunonanoparticles.Methods:Hetero bifunctional cro sslinker SPDP was used to couple covalently McAb HAb18(anti-human hepatoma) wit h mitoxantrone-loaded bovine serum albumin nanoparticles(DHAQ-BSA-NP). A lot o f in vitro experiments,such as slide agglutination test,immunofluorescent assay, i mmunofluorescent blocking test,rosset formation test,rosset formation blocking t est and scanning electron microscopy etc,were used to confirm coupling of antibo dies to nanoparticles and specific binding of immunonanoparticles with target c e lls.³ H-TdR incorporation test was used to assay cytotoxicity of immunonano par ticles to target cells.Results:McAb HAb18 was coupled to D HAQ-BSA-NP. The immunonanoparticles could bind specifically to human hepatoma SMMC-7721 cells and exert selective killing effects on the target cells with do se-dependence.Conclusion:Conjugation technique via SPDP i s a good method for constructing immunonanoparticles. Human hepatoma-specific- immunonano particles have capacity of in vitro selective coating and killing human hepatoma cell line.

Key wordsNanoparticlesMonoclonal antibodyMitoxantrone Human hepatoma

将化疗药物吸附、包裹或夹嵌在白蛋白等生物可降解材料中制成毫微粒(N anop articles，NP)，应用于肿瘤治疗是目前药剂学中研究热点^［1，2］。毫微粒具有载 药 量大、缓释药物、药物无需化学偶联而以游离形式被包封等多重优点，此外它具有靶向给药 特性，即能将药物选择性浓集于病变部位，而不分布或少分布在其它正常部位^{［1，3 ］}。然而毫微粒的这种靶向给药是器官被动靶向，无主动靶向结合癌细胞作用，因此毫微 粒释药杀伤癌细胞同时，不可避免对正常组织造成损伤^［4］。将肿瘤特异性抗体吸 附或交联到载药毫微粒上，制备抗体导向的毫微粒即免疫毫微粒(Immunonanoparticles)，将具 有载药量大、缓释药 物、主动靶向性抗癌作用等多种特性，是一种新型的肿瘤导向治疗制剂 ^［4-6］。我们将抗人肝癌单克隆抗体HAb18与载米托蒽醌(Mitoxantrone,DHAQ)的 牛血清白蛋白毫微粒(DHAQ-BSA-NP)共价交联，构建了人肝癌特异的免疫毫微粒(HAb18-D HA Q-BSA-NP)。本文报道了此免疫毫微粒的制备、体外免疫学结合特性及其选择性抗瘤作用 。

1材料与方法

1.1DHAQ-BSA-NP冻干品本校药学院张志荣教授惠赠，批号981216，4 ℃保存备用。

1.2抗体抗人肝癌单克隆抗体HAb18由第四军医大学病理教研室陈志南教 授惠赠。抗人SIgA单抗4E3纯品由本室自制，本研究中用作对照抗体。免抗小鼠IgG抗血清， FITC标记羊抗小鼠IgG抗体均为华美生物工程公司产品。

1.3主要试剂异型双功能交联剂SPDP为CAL Biochem公司产品，用无水乙 醇配成浓度20 mmol/L；DTT为Serva公司产品； ³H-TdR为中科院上海原子核研究所 产品。

1.4细胞株人肝癌株SMMC-7721，本室保种传代；人胃癌株SGC-7901，本校陈曼玲教授惠赠。

1.5单抗与毫微粒的交联参照文献［4，7］方法加以改进。10 mg单抗经0.05 mol/L,pH7.5的PBS透析，加入SPDP 10 μl，于室温下搅拌30 min，过G-25 柱，用PBS洗脱，首峰即为纯化Ab-PDP，取毫微粒30 mg，超声匀化，同前加入SPDP，搅拌3 0 min,用0.05 mol/L pH4.5的醋酸缓冲 液离心洗涤以去除剩余SPDP，将沉淀(NP-PDP)分散于醋酸缓冲液，加入DTT(终浓度25 mmol /L)，室温搅拌30 min，以还原NP-PDP，用PBS离心洗涤去除剩余DTT，得NP-PDP-SH。将A b-PDP和NP-PDP-SH混合，室温振荡20 h，用PBS离心洗涤数次，沉淀即为免疫毫微粒。

1.6免疫毫微粒的鉴定玻片凝集试验，免疫荧光法均参照文献［5］方法进行。

1.7花环形成实验及花环形成阻断实验^［8］ 取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度HAb18抗体混合 ，4℃作用30 min，用PBS离心洗涤细胞，加入HAb18-DHAQ-BSA-NP，室温振荡30 min，计算花环形成率。

1.8扫描电镜观察参照文献［5］方法进行。

1.9免疫毫微粒与细胞结合的免疫荧光染色同1.6制 备荧光免疫毫微粒(Fluorescent immunonano-particles)。在细胞悬液中加入等体 积荧光免疫毫微粒，4℃孵育30 min，PBS离心洗涤，荧光显微镜观察。

图1免疫毫微粒HAb18-DHAQ-BSA-NP的玻片凝集反应

Fig.1Direct agglutination of immunonanoparticles (HAb18-DHAQ-BSA -NP)

in the presence of rabbit anti-mouse IgG

1.10荧光染色阻断实验取SMMC-7721细胞悬液与不同浓度HAb18抗体 混合，4℃作用30 min，洗涤，加入荧光免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP)，后续步骤同1.6。

1.11免疫毫微粒的细胞毒试验采用 ³H-TdR掺入法，参照文献 ［5］方法进行。洗去游离毫微粒后，继续培养细胞4 d。

2结果

2.1单抗与毫微粒的偶联兔抗小鼠IgG抗血清加入后，原先分散均匀的免 疫 毫微粒形成凝集块(图1)，而普通毫微粒仍处于均匀分散状态。FITC标记的二抗加入后，免 疫毫微粒表面发出明亮黄绿色荧光(图2)，普通毫微粒未见荧光。上述结果证明，单抗(HAb1 8或4E3)已偶联到毫微粒上。

2.2免疫毫微粒与细胞的体外特异性结合7721细胞周围结合有多个H Ab18-DHAQ-BSA-NP(图3)，且结合的免疫毫微粒数量及花环形成与免疫毫微粒 /细胞比率成正比(图4)， 当HAb18抗体(1.0,0.1 mg/ml)预先处理肝癌细胞后，能阻断H Ab 18-DHAQ-BSA-NP结合到肝癌细胞上，扫描电镜显示，多个HAb18-DH AQ-BSA-NP紧密结合在肝癌细胞表面(图5)。免疫荧光染色显示，发出明亮荧光的HAb18-D HAQ-BSA-NP包围在7721细胞周围形成花环(图6)，当7721细胞经HAb18单抗(1.0，0.1 mg /ml) 处理后不能结合荧光免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP)，表现为荧光染色阴性。 证明HAb18-DHAQ-BSA-NP能有效特异性地结合人肝癌细胞。

图2免疫毫微粒(HAb18-DHAQ-BSA-NP)的免疫荧光染色

Fig.2Fluorescence staining of HAb18-DHAQ-BSA-NP

with FITC labeled s heep anti-IgG

图3HAb18-DHAQ-BSA-NP与SMMC-7721结合的光镜照片

Fig.3Light micrograph of the in vitro binding of HAb18-DHAQ-BSA-NP

with SMMC-7721 cells

图4花环形成率与HAb18-DHAQ-BSA-NP/7721细胞比值的关系

Fig.4Relationship between rosset formation and ratio

of HAb18-DHAQ-B SA-NP to SMMC-7721 cells<