摘要目的：尝试将1株来源于人源性噬菌体抗体库的抗HBsAg人Fa b，转换成完整的抗 HBsAg人IgG。方法：采用重叠PCR方法，在抗HBsAg人Fab的Vκ和VH基因 的5’端接上人工合成 的人κ链的前导序列，构建表达完整IgG1的真核表达载体，转染CHO(DHFR^-)细胞，用ELI S A、RT-PCR和免疫印迹检测抗HBsAg人IgG的表达。通过DHFR/MTX体系及金属离子诱导提高Ig 表达。结果：获得表达量在每24 h 1 μg/10⁶细胞的稳定表 达抗HBsAg人IgG的转染细胞系 。并证实所表达IgG具有良好特异性及完整Fc段，其亲和力约为2.1×10⁹ M^-1。又 通 过DHFR/MTX扩增系统的作用及金属离子锌和镉对小鼠金属硫蛋白启动子的激活作用，使IgG 的 表达量提高了约20倍。结论：通过拼接人κ链的前导序列在真核表达 系统成功地将抗HBsAg人Fab转换成完整的HBsAg人IgG1，为其进一步应用打下了基础。

中国图书分类号R392-11

Construction and eukaryotic expression of anti -HBsAg human IgG

CHEN Xiao-SuiZHU Ying-ChunWANG Yu-Xiao

（Navy General Hospital, Beijing100037）

AbstractObjective：To convert anti-HBsAg human F ab derived from phage antibody l ibrary to whole human IgG molecules expressed by eukaryotic cells.Met hods：A syn thesized human Vκ leader sequence was spliced to anti-HBsAg VH and Vκ by over lap PCR.Eukaryotic expression vectors were constructed and transfected into CHO(DHF R^)cells.The expressed IgG was analyzed by ELISA,RT-PCR and Western blot. DH F R/MTX system and metal ion induction were used to ampify IgG production.Results：Stable transfectant were obtained after selection and subcloning among which th ree produced human IgG up to 1.0 μg/10⁶/24 h.The expressed human IgG was pr ov ed to bind to HBsAg specifically, contain intact Fc portion and possess an assoc iation constant of 2.1×10⁹ M^-1by ELISA, RT-PCR and Weastern bolt an alysi s. The expression level could be increased up to 20 times by DHFR/MTX amplificat ion system and metal ion Zn²⁺and Cd²⁺induction.Conclution：These res ults proved the successful conversion of anti-HBsAg human Fab fragments to whol e hIgG molecules with good specificity and affinity.

Key wordsPhage antibodyHBsAgHuman antibodyEukaryot ic expression

乙型病毒性肝炎是一种发病率高且危害性大的疾病，抗乙肝病毒表面抗原(H BsAg)的人源 性 抗体在临床上有防治乙肝的应用前景，如用于预防新生儿的乙肝病毒的垂直传播和制备治 疗性乙肝疫苗^［1，2］。但人单克隆抗体的制备一直较为困难，噬菌体抗体库技术的 出现使多年来人源性抗体制备的难题得到了解决。通过这条新途径，各种人源性抗体不断出 现，已显示出其作为体内诊疗制剂应用与发展的诱人前景。我们在以前的工作中曾用噬菌体 抗体库技术从接种过乙肝疫苗的个体克隆到两株不同的抗HBsAg人Fab段基因^［3，4］ 。从抗体库中获得的抗体可变区基因可在大肠杆菌表达的小分子抗体，在某些情况下，尤其 用于体内治疗，需要Fc段的生物学效应功能，因此需制备完整的抗体分子，本研究试图将其中一株抗HBsAg Fab转换成真核表达的完整的人IgG1，并通过扩增的方法提高人IgG在CHO细 胞中的表达量。为其进一步应用打下基础。现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1质粒和细胞株抗HBsAg人Fab基因的载体质粒p3HB2-1由本室构建^［4］，大 肠杆菌菌株XL1-Blue由本室保存。可同时表达人轻、重链的真核表达载体(含DHFR基因)pDH L 由中科院微生物所阎锡蕴教授惠赠。人κ链前导序列的载体质粒pUCL由本室构建。CHO(DHFR ^-)细胞系由军事医学科学院沈倍奋教授惠赠。

1.2寡核苷酸引物前导序列的设计与合成，用于扩增VH和Vκ以及将前 导序列与VH、Vκ拼接的引物LEK、HK3、LEH、HG3、SIG、PDVK3及PDVH3，见文献［5］。

1.3真核表达载体的构建分别用LEK+HK3和LEH+HG3从原核表达载体上扩 增与前导序列3 ’端互补的κ链和Fd段，再通过重叠PCR，以所获κ段或Fd段与含前导序列的质粒pUCL互为 引 物和模板PCR扩增7圈，补加前导序列5’端引物SIG和Vκ3’端引物PDVK3或VH3’端引物PDVH 3，继续扩增30圈，获得400 bp左右的带前导序列的Vκ和VH基因。经琼脂糖电泳分离、纯化 、电洗脱回收后分别将Vκ和VH重组到真核表达体pDHL的相应部位。得表达载体pDHLHB2。

1.4CHO细胞的转染和克隆化培养取表达载体DNA 0.4 μg，加到含有4 μ1Plus Reagent 的25 μ1无血清IMDM培养基中，室温置15 min；另取LipofectimAMINE Reagent 1 μ1加入2 5 μ1无血清IMDM中。以上两种液体混合后室温置15 min，取混合液逐滴加入1×10⁵CHO 细胞 /200 μ1无血清IMDM培养基中。37C培养3 h后，补加含10%小牛血清的非选择培养液至 1 m1。次日吸出细胞上清，换入1 m1非选择性培养基，48 h后取上清检测IgG的瞬时表达。 同 时用有限稀释 法在96孔板上进行转染细胞的克隆化培养，加入选择性培养基(不含次黄嘌呤 和胸腺嘧啶的IMDM培养液)。10 d后开始检测单克隆，挑出阳性孔细胞继续进行亚克隆化培 养，直至所有亚克隆细胞100%为阳性克隆，稳定表达IgG的单克隆细胞。

1.5氨甲喋呤(MTX)对IgG表达的扩增挑选表达抗HBsAg人IgG的单克隆 转染细胞系，在 选择培养液中加入10^-7mol/L MTX，培养细胞2 w后做亚克隆培养，挑选出表达量提 高的 单克隆细胞，继续用MTX加压，浓度至10^-6 mol/L，2 w后同上处理。再将MTX增加到 10 -5 mol/L。检测加压后生长的亚克隆细胞培养上清中的人IgG表达量和与抗原的结合活 性。

1.6金属离子锌和镉对MTI启动子的激活在转染细胞的培养液中加入 不同浓 度硫酸锌(0.78～200 μm)和硫酸镉(0.007～2 μm)，1 w后，检测细胞培养上清中 IgG的表达。

1.7ELISA

1.7.1IgG表达量的测定用羊抗人IgG Fab包被ELISA板。1% BSA-PBS封闭后 ，加入细胞培养上清和不同浓度的标准人IgG，37C 1 h，洗3次后，加入HRP-羊抗人I gG 37C 1 h，洗3次后，加入OPD底物液显色 ，测A₄₉₀值。

1.7.2IgG与抗原结合活性的测定用重组HBs Ag 0.9 μg/ml包被ELISA 板 (同时用多种抗原液包被作对照)，其余步骤同上，测定细胞上清的抗原特异性结合活性。

1.8RT-PCR用Trizol按产品说明书从1×10⁷转染细胞中提取总RNA 。逆转录后PCR扩 增IgG的各片段，以证实转染细胞中存在人IgG的轻链和重链mRNA。

1.9免疫印迹试验取抗 HBsAg人IgG和标准人IgG进行12%的SDS -PAGE电泳，电转移至纤维膜上，5%脱脂奶粉-PBS 4C封闭后，加入HRP-羊抗人IgG(γ 链)和HRP-羊抗人Fab(κ链)，孵育2 h，洗涤后，加入DAB液显色。

1.10亲和力测定采用非竞争性酶免疫法，抗HBsAg IgG从8 mmol/L浓 度倍比稀释后加样^［6］。亲和力计算公式：K＝n-1/2(n［AB’］-［AB ］)。

2结果

2.1完整人IgG表达载体的构建通过重叠PCR拼接法将人工合成的一个人 κ链的前导序列 和抗HBsAg的Vκ和VH拼接在一起，并重组装到pDHL中得到表达载体pDHLHB2，如图1所示，PM T I为小鼠金属硫蛋白I启动子，Cκ为轻链恒定区基因，CH₁、CH₂、CH₃为人IgG1重链恒 定区基因，DHFR为二氢叶酸还原基因，XbaI和BamHI之间为轻链可变区基因，XhoI和HindIII 之间为重链可变区基因。

图1表达载体pDHLHB2示意图

Fig.1Expression vector pDHLHB2

图2人IgG mRNA的RT-PCR检测

Fig.2RT-PCR ampliqication of the human IgG mRNA

Note：M1.γDNA/EcoR 91I;M2.PBR 322 DNA/BstNI

图3表达的人IgG的免疫印迹检测

Fig.3Western Blot of the expressed human IgG

Note:1.expressed IgG；