摘要目的：探讨一种新型重组融合基因抗体导向溶栓剂SZ51Hu-scuPA的体外溶栓效力。方法：通过转瓶扩大生产获得的大量 基因重组融合蛋白SZ51Hu-scuPA，通过抗体竞争结合实验确定融合蛋白的抗体亲和力；进 而与尿激酶进行不同浓度血小板血浆凝块体外溶栓比较。结果：该融合 蛋白体外纤溶活性为39 000 U/mg；其抗体亲和力是鼠源性单抗的67%；体外溶栓效力较uPA 提高4.1～8.4倍。结论：体外溶栓结果证明，融合蛋白SZ51Hu-scuPA 既兼有与人活化血小板结合特性又有纤溶酶原激活剂特性的双功能分子，是一种新型的抗体 导向溶栓剂。

中国图书分类号 R73-354

Study on thrombolysis of a new recombinant ant ibody-targeted plasminogen activator in vitro

WAN Hai-YingLIU Zheng-HuiGU Jing-Ming

（Jiangsu Institute of Hematology,the First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College, Suzhou 215006）

AbstractObjective：To compare the thrombolytic propertie s in vitro between urokinase(uPA) and the recombinant chimeric plasminogen activ a tor SZ51Hu-scuPA,which was composed of a humanized monoclonal antibody SZ51(SZ5 1 Hu) specifically against activated human platelet and a single-chain urokinase( scuPA).Methods:The fusion protein SZ51Hu-scuPA was produc ed from the supernatant of a stable myeloma cell line growing in spinner flask,a nd then purified by chromatography on a GAH IgG-Sepharose 4B affinity column.Th e binding capacity to activted human platelet of purified fusion protein SZ51Hu -scuPA was obtained by antibody competitive binding assay.The thrombolytic acti vity was determined by lysis of ¹²⁵I-fibrin-labelled human plasma cl ots.Results:SZ51Hu-scuPA affinity was 67% of the SZ-51M an d the fibrinolytic activity was 39 000 U/mg. The lysis of the clots by SZ51Hu-s c uPA was 4.1～8.4 fold more potent than uPA.Conclusion:Th e fusion protein SZ51Hu-scuPA was more competent to dissolve platelet clots than uPA and it was a new recombinant antibody-targeted plasminogen activator in vit ro.

Key wordsActivated platelets Monoclonal antibodySi ngle-chain urokinaseGene expressionTargeting thrombolysis

抗人活化血小板GMP-140单抗SZ-51(SZ-51M)，经放射性核素^99mTc标记后(^99mTc-SZ51)不仅在实验性狗股动、静脉血栓模型中，而且在人 体内血栓显像中都显示了良好的显像效果^［1］，证明了其血栓导向能力 。与尿激酶的化学偶联产物体外溶栓率较单用尿激酶提高了3～5倍^［2］。本研究对通过基因工程方法获得的分泌重组SZ51Hu-scuPA抗体导向溶栓剂^［3］的阳性细胞克隆进行了体 外扩大培养，应用亲和层析技术纯化SZ51Hu-scuPA融合蛋白，与uPA对¹²⁵I标记纤维 蛋白原的不同血小板血栓凝块在体外进行了溶栓比较，以期得到一种新型的基因工程抗体导 向溶栓剂。

1材料与方法

1.1实验材料人尿激酶纯品由南京大学制药厂朱长生教授惠赠，比活为155000 U/mg；人纤维蛋白原购自Sigma公司；重组SZ51Hu-scuPA的SP2/0细胞株由本室保存。

1.2实验方法

1.2.1细胞扩大培养最初接种采用集合多个小方瓶培养的细胞，弃上清 ，以1×10⁵ ml^-1细胞密度接种于转瓶(500 ml玻璃转瓶及搅拌动力系统为Bellco公 司产品)， 再次接种时可从生长细胞的转瓶内直接取细胞进行接种。培养基为RPMI1640，补加葡萄糖至 4.5 g/L,置CO₂培养箱，37 ℃培养，调节转瓶内转子旋转速度为20 r/min，待细胞停止生长后，继续培养12～24 h，离心收集上清，-70 ℃储存备用。

1.2.2亲和层析纯化SZ51Hu-scuPA应用GAH IgG-Sepharose 4B亲和层 析柱纯化SZ51Hu-scuPA重组融合蛋白。SZ51Hu-scuPA融合蛋白中相关IgG和相关scuPA抗原 定量采用ELISA或RIA法，scuPA酶活性单位定量采用纤维蛋白平板法^［4］。

1.2.3鼠源性单抗SZ-51(SZ-51M)和纤维蛋白原的¹²⁵I标记采用 Iodogen法^［5］标记蛋白。经20%三氯醋酸沉淀法测得标记率为96%～98%。纤维蛋 白原标记¹²⁵I(¹²⁵I-Fg)后的可凝蛋白百分比测定，取5 μl ¹²⁵ I-Fg ，加入0.5 ml人血浆，再加入过量凝血酶，37 ℃放置30 min，离心弃上清，测定凝块的放 射性计数。由凝块的放射性计数/加入¹²⁵I-Fg总放射性计数×100% 计算得可凝蛋白百分比为96%。

1.2.4SZ-51Hu-scuPA与SZ-51M的抗体竞争结合试验于经凝血酶活化 的 血小板中加入等体积0.25%戊二醛，室温下固定1 h，0.3% BSA-PBS重悬，计数血小板 。取5× 10⁷血小板加入¹²⁵I-SZ51M(5×10⁴ cmp,0.65 μg/ml)和不同浓度(20.8 μg/ml 倍比稀释)的未标记SZ-51Hu-scuPA纯品，阴性对照为SZ-2(抗血小板GPIb单抗)，总体积1 00 μl，37 ℃反应2 h，用0.01 mol/L,pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，测定血小板沉淀物的 放射性计数，计算结合率。

1.2.5不同浓度血小板血浆凝块的血栓制备取健康供血者新鲜全血(3.8% 枸橼酸三钠1∶9抗凝)，分离PRP血浆(2.5×10⁵血小板/μl)；PPP血浆(1×10⁴ 血小板 /μl) ；再富集PRP血浆(R-PRP：12×10⁵ 血小板/μl)。分别向PRP、PPP和R-PRP血 浆中按下 列顺序加入¹²⁵I-Fg(终浓度500 000 cpm/ml)，CaCl₂(终浓度0.05 mol /L)，凝血酶(终浓度1 U/ml)，混匀后立即吸入内径3.5 mm的硅胶管内，37 ℃静置30 mi n，将含有凝块的硅胶管切成1.5 cm长的小段(约含0.12 ml血浆)，取出不同血小板浓度的血 栓凝块(分别称为PPP、PRP、R-PRP血栓)，用0.9% NaCl 3 ml洗涤2次，弃上清后对血栓做 总放射性计数，于每只栓子中加入1 ml PPP血浆。

1.2.6体外溶栓取上述制备的含有PRP、PPP和R-PRP3种血栓的血浆， 再分成4组：生理盐水组、尿激酶组、尿激酶与SZ51M等摩尔混合组(uPA+SZ51M)以及SZ51Hu -scuPA融合蛋白组。每组分别加入终浓度10、20和50 U/ml酶活性单位的溶栓剂1 ml， 设3个平行管进行溶栓试验。置37 ℃温箱溶栓1、2、4和24 h，各点分别取出100 μl上 清做放射性计数。溶栓率=血浆中放射性计数/溶栓前栓子的总放射性计数×100% 。

1.2.7纤维蛋白原浓度测定按Kit说明书进行(纤维蛋白原测定Kit为Stag o公司产品)。

2结果

2.1SZ51Hu-scuPA的纯化采用GAH IgG-Sepharose 4B 亲和层析方法对 收集的转瓶1 L上清进行纯化得纯品3 mg左右。酶活性为39 000 U/mg总蛋白。

2.2SZ51Hu-scuPA与SZ-51的竞争结合试验¹²⁵I标记SZ-51M与 未标记的融合蛋白SZ51Hu-scuPA与活化血小板保温后，融合蛋白显示出和SZ-51M有 竞争结合活化血小板的剂量依赖性效应(图1)。当¹²⁵I-SZ-51M与血小板的结合率下 降了一半，即被加入的融合蛋白抑制了50%，此时融合蛋白IgG的加入量为0.98 μg/ml，而 ¹²⁵ I-SZ-51M为0.65 μg/ml。

图1 ¹²⁵I标记鼠源性单抗SZ51与未标记融合蛋白

SZ51Hu-scuPA之间竞争结合人活化血小板

Fig.1Competitive binding between ¹²⁵I-mouse SZ51 and

nonl abelled fusion protein SZ51Hu-scuPA towards human activated platelets

2.3体外溶栓效率为了比较融合蛋白的溶栓效率，我们以不同浓度的血小板制备血栓，在10、20和50 U/ml 3种溶栓剂量(阴性对照组为生理盐水，阳性对照组为u PA和uPA+SZ51M)下，测定不同时间(1、2、4和24 h)的溶栓效率。表1列出了3种浓度血小 板的血栓(PPP：1×10⁴血小板/μl；PRP：2.5×10⁵血小板/μl及R-PRP：12×10⁵血 小板/μl)在不同剂量、不同时间的溶栓结果。显示在PPP组除阴性对照组无变化外， 阳性对照组在溶栓4 h后，溶栓效率呈增高趋势，而SZ51Hu-scuPA在所有剂量下 溶栓1 h即产生较高的溶栓效率，2 h比相同剂量的阳性对照组的溶栓率高7.2倍，4 h已接近 完全溶栓。PRP中阳性对照组只在4 h才显示出溶栓，其它时间的所有剂量组的溶栓率均在 10%左右。然而SZ51Hu-scuPA 10 U/ml时，溶栓4 h后，溶栓率在21%；20 U/ml时，2 、4 h溶栓率分别达17.1%及39.3%；而50 U/ml时溶栓率在1 h就已达44.1%，24 h各剂量组 的溶栓率均达完全。在R-PRP组的溶栓情况与PRP组基本一致，只是在高剂量组( 50 U/ml)时的溶栓率略低于PRP组。另外，在各溶栓剂量组的溶栓过程中，纤维蛋白原的