摘要目的：TNF-α可以分泌型(S-TNF)及其前体膜型(M-TNF) 两 种活性形式同时存在于体内。为膜型TNF的转基因应用，构建一种可表达于胞膜而不被酶解 的膜稳定型TNF重组体(mTNFm)。方法：在克隆M-TNF cDNA的基础 上，删除两型TNF转换酶酶解部位的编码序列，构建出mTNFm并测序验证；建立只表达膜型T N F的真核细胞株。结果：Western blot分析及活性测定结果表明，mT NFm不再发生酶切转换且只通过效-靶细胞间直接接触发挥胞毒效应。通过基因直接注射 方式 ，使mTNFm稳定表达于小鼠体内。结论：所构建的mTNFm及其表达细 胞株可用于膜型TNF生物学效应的研究及基因治疗。

中国图书分类号R371-34

Construction of a human stable transmembrane mutant TNF-α recombinant and its eukaryotic expression

HUANG Jia-Qiang

（Laboratory of Medical Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083）

BU XiaLI Zhuo-Ya

（Department of Immunology,Tongj i Medi cal University,Wuhan 430030）

AbstractObjective： TNF-α exists as bo t h transmembrane form(M-TNF)and secretory form(S-TNF).A kind of M-TNF recombin ant with a stable,uncleavable mutant type(mTNFm)was constructed for its gene therap y.Methods: On the basis of cloning the M-TNF c D NA encoding region,the authors constructed mTNFm,which could potentially expre ss on the c ell surface with a uncleavable type of TNF resulting in deletion of the sequence encoding enzymatic cleavage site of TNF-α-converting enzyme.The cell clones ex pressed mTNFm were selected and identified,and their cytotoxic effect analyzed s ubsequently. Results:mTNFm could express as a s table transmembrane type and act chiefly through cell-to-cell contact.In addit io n, in vivo experiments on mice demonstrated that both the gene mutant and its expression products were persistently present in the local injection sites by d irect gene injection.Conclusion: This table M-Tnf gene mutant clone can be suited for the research of bioactivity and gene therapy of M-TNF.

Key wordsTransmembrane TNF-αGene mutati onEukaryotic expressionDirect gene injectionGene therapy

跨膜型TNF-α(Transmembrane TNF,M-TNF)是TNF-α(TNF，下同)编码基因表达的具有活 性的2 6 kD膜结合前体形式^［1］。M-TNF可被TNF-α转换酶(TNF-α-converting enzym e,TA CE)酶解产生17 kD的分泌型TNF(Secrectory TNF,S-TNF)^［2］。近年来研究表明，T NF的两种形式在受体结合、生物学效应等方面各具特征^［3，4］。M-TNF通过直 接 接触在组织局部中发挥效应的特性，有望克服S-TNF在生物治疗应用中引起的远端及全 身性毒副作用。但由于两型TNF可同时存在于体内，影响了对其各自作用特点和生 物学意义的研究及区分。为此，本文在克隆M-TNF cDNA编码序列(mTNF)的基础上，通过删除 TACE的酶解部位编码序列(Val¹～Pro¹²)而构 建出M-TNF的基因突变体(mTNFm)，使之以一 种不被酶解的膜稳定型(M-TNFm)表达于胞膜；建立只表达膜型TNF的真核细胞株，且使M-T NF m在Balb/c小鼠体内获得稳定表达。从而为研究两型TNF的生物学效应及作用机制提供了 体内外实验模型，为M-TNF的基因治疗提供了实验依据。

1材料与方法

1.1菌株、质粒和细胞大肠杆菌XLI-BlueMEF′和穿梭载体pBK -C MV由翦必希博士惠赠；细胞株NIH3T3购自武汉大学中国典型物保藏中心，L929为本室保存。

1.2实验动物5周龄Balb/c小鼠，购自江西省动物中心，雌雄各半。

1.3主要试剂TRIzol试剂、Superscript逆转录试剂、T4DNA连接 酶、限制性内切酶、G418(GIBCO)，DOTAP转染试剂(Boehringer Mannhein,BRM)，四甲基偶 氮唑盐(MTT,Fluka)，hTNF ELISA检测试剂盒、抗hTNF-α单抗(anti-TNF McAb,北京邦定) ，羊抗鼠IgG荧光标记抗体(SABC)，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。

1.4M-TNF cDNA(mTNF)及其突变体(mTNFm)的引物设计^［5］ mTNF扩增引物，P1：5′-GCGGATTC ATGAGCACTGAAAGCATGATCC-3′,P2:5′ -CCC AAGCTTTCACAGGGCAATGATCCCAAAG-3′(划线处分别为Bam HI、HindIII切 点) ；mTNFm扩增引物由一对外侧引物(即P1和P2)和一对内突变重叠引物P6和P7组成，P6：5′- T CA AAC ATG GGC TAC TGC CTG GGC CAG AG-3′,P7:5′-AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTA G CC CAT GTT TG-3′。

1.5mTNF的克隆及测序常规方法提取LPS(100 ng/ml)刺激4 h的人外周血单核细胞总RNA，逆转录合成cDNA第1条链为模板，PCR扩增mTNF，酶切，定向连接于 pBK-CMV，重组成pBK-mTNF,ABI 373A型DNA 自动测序仪测定克隆片段的核甘酸序列。

1.6mTNFm真核表达质粒的构建及测序采用重叠延伸突变PCR法(Mutagenesis by overlapping extension PCR,MOE-PCR)^［5］(图1)。模板为pBK-mTNF ， 分别用P1和P6、P7和P2扩增基因片段C、D，PCR条件为：94℃，4 min;49℃，1 min,60℃，3 0 s(片段 C)或1 min(片段D)，72℃，30 s(片段C)或1 min(片段D)，循环28次；72℃，10 min。电泳 回收纯 化片段C、D后，各取1 μg混合作为模板，以上述1对外侧引物P1和P2进行PCR扩增，反应条 件为：94℃，10 min，50℃，10 min；72℃，10 min，共25个循环。电泳回收纯化PCR产物 ，按上述方法构建出mTNFm的真核表达质粒，命名为pBK-mTNFm并测序。

图1TNF表达质粒的构建及鉴定

Fig.1The construction and identification of TNF recombinants

1.7细胞转染及筛选^［6］按DOTAP试剂盒和说明将pBK-mTN F 、pBK-mTNFm及其对照pBK-CMV转入NIH3T3细胞，继续培养48 h后，分别取部分细胞培养于 8孔 玻片(BRM)进行间接免疫荧光检测。其余细胞按1×10⁵个/孔接种于24孔培养板内，加选择 培养基，3 w后选择培养基逐渐减量，4 w后减至一半，并用有限稀释法对阳性克隆进行亚 克隆。

1.8克隆细胞株表达产物的鉴定

1.8.1表达产物生物活性的检测与筛选采用MTT法。收集1×10⁶ 转 染细胞培养上清检测上清(S-TNF)对靶细胞L-929的细胞毒活性^［7］；转染细胞用1 % 多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，按效：靶比例10∶1加入L-929，参照文献 ［8］检测膜结合型TNF(M-TNF)对靶细胞L-929的胞毒活性。

1.8.2表达产物的Western-Blot分析^［6］转染细胞传代 培 养24 h后，收集1×10⁶细胞及其培养上清(Amicon浓缩器离心透析浓缩)，进行Western- Blot分析。

1.9mTNFm重组体体内表达实验^［9］将pBK-mTNFm(100 μg /只 )分别直接注射于0.5%布比卡因(50 μl/只)预处理的Balb/c小鼠背部皮下及左后肢股四头肌内，于第7、14、21、30天分别采集外周血血清及注射部位组织；分别用间接免疫荧光法 和PCR检测TNF重组体基因和表达产物；用ELISA检测小鼠外周血血清中重组TNF(hTNF)水平。

2结果

2.1mTNFm的构建及鉴定RT-PCR扩增mTNF，重组成pBK-mTNF，测 序 验证后作为模板，分别以P1和P6、P7和P2扩增基因片段C、D，取片段C、D混合作为模板，通 过外侧引物P1和P2扩增mTNFm(图1)。测序分析证实mTNFm突变成功(图2)。

图2mTNFm的核苷酸序列测定结果

Fig.2The nucleotide seqencing result of mTNFm

2.2mTNFm的真核表达与鉴定通过检测TNF重组体转染细胞阳性克隆中对L-929的胞毒活性，筛选出活性较高的阳性克隆细胞各1株，分别命名为H-mTNF、H- mTN Fm，并进行Western blot分析(图3)及活性测定(图4)。结果：①H-mTNF的培养上清可检出1 7 kD的单一反应条带，而裂解液可同时检出17和26 kD双反应条带，且其固定细胞及培养 上清均具胞毒效应；②H-mTNFm则仅细胞裂解液可检出26 kD TNF，其培养上清未检出特异 性反应条带，且仅其固定细胞具有细胞毒活性；此外，以上胞毒效应均可被抗hTNF单抗所中 和(图4)。

图3TNF 重组体转染细胞表达产物的Western Blot分析