设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
中国图书分类号S852.65
Cloning,sequencing and expression of VP2 gene of CAV-SJ1 strain
YANG Yu-HuiCHEN Jiang-Li
（State Key Labratory of Veterinary Biotechnology,Harbin Veterinary Research Insti tute,CAAS,Harbin150001）
AbstractObjective：Research molecular biology character o f chicken anemia virus.Methods:The authors acquired VP2 ge ne by PCR amplifing method,and insert VP2 gere into PUC119 plasmid by cloning f or sequencing. Then the VP2 gene of SJ1 was inserted into expressing plasmid PET by subcoloning.Results:The result of sequencing demonstra te VP2 gene contains of 651 bp,which differs from those of TK5 803,26P4,Cux-1,82-2. There are 6,7,8,7 difference in VP2 between SJ1 strain an d TK5803,26P4,Cux-1,82-2. VP2 gene was successfully expressed,The authors get t he fushion protein of 34 kD.Conclusion:Molecular biology character of chicken animia virus is stable.
Key wordsCAVVP2CloningSequenceExpression
鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)是近二十几年才发现的一种新病毒 ，它的感染可以引起雏鸡严重的贫血和胸腺萎缩，甚至造成死亡。亚临床感染则引起雏鸡食欲下降并导致雏鸡对其它疾病如：传染性法氏囊(IBD)、马立克氏病(MD)、和新城疫(ND)等 疾病的易感性增强，是当前危害养禽业的重要病原之一。
CAV含有3个开放的阅读框架，分别编码3种蛋白质(VP1、VP2、VP3)。有关研究表明VP1是CAV 唯一的结构蛋白，VP2为辅助蛋白，与病毒的装配有关，而VP3是CAV的致病性蛋白［1］ 。其中VP1、VP2和病毒的免疫保护有关［2］。
本研究设计了一对扩增CAV VP2基因的引物，通过质粒PCR将其扩增出来，并通过平端连接将 其克隆于PUC119之上，并表达之，这为进一步开展CAV的分子生物学的研究和研制CAV的基因 工程疫苗打下了基础。
1材料与方法
1.1PCR模板以含有VP2基因的SJ1株的PUC-CAV1. 5 kb重组质粒为模板(由本室提供)［3］。
1.2引物设计和PCR扩增根据基因银行记载的Cux-1株的DNA序列 设计了 扩增CAV-SJ1株VP2基因的引物：VP2-1、5’-TAGGCGGATCCAAGTGGATGCAC-3’；VP2-2、 5’-CCATAGTCATAGTAGATTGGC-3’。在VP2-1上改造了一个BamHI酶切位点。
1.3PCR扩增取适量的PCU119-CAV1.5 Kb DNA于500 μl的Eppendorf管 中，与2 μl正向引物、2 μl反向引物、8 μl dNTP(10 mmol/L)、2 U Taq DNA聚合酶(Pro mega)、10 μl buffer混合加入灭菌的去离子水至100 μl，置于PTC 100 PCR程控循环仪( 美国JM-Research)上，95℃变性5 min以后，以94℃ 1 min、50℃ 1.5 min、72℃ 1 min循 环35次，最后72℃延伸10 min。
1.4VP2基因的克隆将SJ1株的VP2基因的PCR产物用T4 DNA聚合酶 和多聚核苷酸激酶处理后，与SmaI酶切的PUC119载体连接，转入JM83受体菌。
1.5克隆质粒的提取鉴定小量法提取质粒用BamHI单酶 切和BamHI/EcoRI双酶切筛选克隆于PUC119上的正向重组质粒［4］。用BamHI/EcoRI双酶切筛选克隆于PET-28c上的阳性重组质粒。
1.6克隆质粒测序对重组质粒的测序用M13引物，DNA自动测序仪为AB137 7PR1SM，由宝生物工程公司大连分公司的DNA合成和分析实验室测定。6%聚丙烯酰胺凝胶，在2000 V电压8 h左右，通过计算机分析结果。
1.7VP2基因的亚克隆用BamHI/EcoRI双酶切PUC119-VP2正向重组质粒， 切下的VP2基因与同样酶处理的PET-28c质粒粘端连接。
1.8VP2基因的表达用含有SJ1株VP2基因的PET-28c重组质粒转化到BL(D E3)受体菌，取单个菌落接种至50 ml含氨苄青霉素的LB培养基中振摇过夜。次日取1～2 ml 菌液接种至新的50 ml培养液中，37℃培养至A600OD为0.6加100 mmol/L的IPTG至浓度 为10 mmol/L继续培养3～4 h。
1.9SDS-PAGE电泳分析取诱导后细菌培养物，离心收集菌体，加上样缓 冲液煮沸5～10 min，取50 μl上样进行SDS-PAGE电泳，电泳后用考马斯亮蓝染色。用Pha rmacia产的Image Master VDS分析融合蛋白VP2的含量。
2结果
2.1SJ1株VP2基因的序列分析结果见图1。
图1鸡贫血病毒SJ1株和国外4株鸡贫血病毒的序列 比较
Fig.1VP2 nucleotide sequence of the positive strand CAV
SJ1 DNA wit h comparasions to the reported sequence of foreign CAV
Note:One by one is TK5803,Cux-1,26P4,82-2 in the brac hets
2.2VP2基因的表达产物的分析结果SDS-PAGE电泳分析结果 见图2，质粒阳性菌与对照相比，含VP2表达重组质粒的受体菌均含有34kD的蛋白谱带，其大小与实验设计相符，用Pharmacia产的Image Master VDS分析融合蛋白VP2的含量为10.5%。
图2CAV-SJ1株VP2基因的大肠杆菌表达产物的SDS- PAGE的电泳分析
Fig.2Expressing protein of VP2 gene of CAV-SJ1
strain was analysed by electrphoresis on SDS-PAGE
Note:M.Protein marker;1.Comparasion to negative
term;2-5.Germ including re combinant plasmid of PET-SJ1-VP2
3讨论
CAV-SJ1株的VP2基因含有651个碱基，同国外CAV的TK5803、26P04、Cux-1、82-2毒株的V P2基因序列相比分别有6、7、8、7个碱基的差异，其中3个是SJ1株特有的碱基变化(见结果 序列)，由CAV-SJ1株VP2基因序列推导的氨基酸序列同国外CAV的TK5803、26P04、Cux-1、 82-2毒株的VP2蛋白的氨基酸序列相比分别都有4个氨基酸的差异，CAV-SJ1株的VP2蛋白同 这些国外毒株的VP2蛋白一共有7个氨基酸的差异。在第77个氨基酸SJ1株是Ser，其它4种毒 株 是Asn；在第153个氨基酸是Cux-1，其它4种毒株是Val；在第160个氨基酸82-2株是Lys其 它 4种毒株是Gln，在第167个氨基酸SJ1株是Gln，其它4种毒株是Glu；在第176个氨基酸SJ1株 是Tyr，其它4种毒株是Asp；在第185个氨基酸TK5803株是Val，其它4种毒株是Asp；在第 186个氨基酸26P4株是Gly，其它4种毒株是Glu。
VP2蛋白是协助蛋白，与病毒的装配有关，而且VP2也是病毒的保护性抗原，VP2基因的序列 分析结果将为深入VP2的功能打下基础。VP2的序列内部含有完整的VP3序列，VP3是近年来研 究的热点，主要是它可以有诱导肿瘤细胞凋亡却不能使正常细胞凋亡［5］。所以VP2 基因的序列分析结果为研究VP3的功能也打下了基础。
VP2基因含有651个碱基大约编码216个氨基酸，推导其分子量大约为24 kD。但许多报道指出 ，细胞培养物中的VP2蛋白的分子量以及用载体表达的产物，它们的分子量都为28～30 kD左 右。本次实验以PET-28c为载体，初步表达的CAV基因产物经SDS-PAGE分析，在34 kD左 右 。因为本实验中阅读框架除了VP2本身的编码序列外，还包括从载体本身携带的启动密码子 后的33个氨基 酸序列，因此表达产物形成的融合蛋白的分子量应为34 kD。表达产物的大小与实验设计相 符 。VP2基因的表达量高达10.5%，这一结果将有助于VP2蛋白的纯化。这必将为研究以VP2 蛋白 为抗原制造疫苗和诊断试剂提供有利的物质基础。有关产物的活性正在进一步的鉴定中。
作者简介：杨雨辉，男，硕士，主要研究分子生物学；
陈奖励，男，博士，主要研究分子生物学
4参考文献
1，Noteborn M G,Bo
