摘要目的：研究PKA对跨膜型TNF-α(mTNF-α)和分泌型TNF- α (TNF-α)杀瘤效应的影响。方法：用TNF生物活性检测方法在体外 观察PKA激活剂和抑制剂对二型TNF- α杀伤不同肿瘤细胞的影响。结果：PKA激活剂Forskolin(10 μmol/L)和抑制剂H8(15 μmol/L) 可 分别增强和抑制sTNF-α对其敏感靶细胞的胞毒活性，对其余4株耐受靶细胞却无逆转作用 ，而且对mTNF-α的胞毒效应无任何影响。此外，PKA活性增强，可使sTNF-α介导靶细胞 的死亡方式发生改变，即坏死比例减少，凋亡比例增加。结论：PKA仅参与sTNF-α胞毒作用的信号传导，与mTNF-α无关； 且与sTNF-α介导靶细胞凋亡有关。

中国图书分类号R371-34

Effect of PKA on the cytotoxicity of transmembrane and secretory tumor necrosis factor-α

SHI Wen-FangLI Zhuo-YaGONG Fei-Li

（Department of Immunology,Tongji Medical University,Wuhan 430030）

AbstractObjective： To study the influe nce of PKA on the tumoricidal effect of transmembrane tumor necrosis factor-α( mTNF-α)and secretory TNF-α(sTNF-α).Methods: The effect of PKA activator and inhibi tor on the both forms of TNF-α was studied with TNF-α bioassay.Results:It was found that the activator(Forsko lin,10 μmol/L)of PKA potentiated,while its inhibitor(H8,15 μmol/L) depressed t he cytotoxic effect of sTNF-α on target cell lines sensitive to the cytokine.The se agents,however,were not capable of reversing the state of reactivity of the o ther four cell lines from tolerant to sensitive to sTNF-α,nor did it affect th e cytotoxicity of mTNF-α.Furthermore,increased activity of PKA was a reduced p roportion of necrosis and an increased one of apoptosis.Conclusion: PKA m ay be involved in the cytotoxic effect of sTNF-α rather than that of mTNF-α and may be associated with apoptosis induced by sTNF-α.

Key wordsTumor necrosis factor-αTransmemb raneSecretoryCytotoxicityNecrosisApoptosis

我们近来证实跨膜型TNF-α(transmembrane tumor necrosis factor-α,mTNF-α)比 分 泌型TNF-α(sTNF-α)有更广的杀瘤谱，即mTNF-α可有效杀伤对sTNF-α耐受的肿瘤细 胞^［1］；而且二型TNF对TNF受体作用有各自特征^［2］。提示二型TNF的受体 后信号传导有差异。本研究旨在比较PKA对二型TNF胞毒效应的影响。

1材料与方法

1.1主要试剂细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,E.coli 0127:B8 ,Difco,美国)；TNF-α单克隆抗体(邦定公司)；Forskolin、H8、碘化丙啶(PI)和Hoechst3 33258购自Sigma公司，美国。

1.2细胞培养以HepG2(人肝母细胞瘤)、MCF-7 (人乳腺癌)、HL-60(人急性前髓 细胞性白血病)、K562(红白血病)、Raji(B 淋巴细胞性白血病)、L929 (鼠成纤维母细胞)作为靶细胞。全部细胞用含15%FCS的RPMI1640 完整培 养基培养。

1.3TNF-α的诱生、获取及活性测定取健康成人静脉血，用常规方 法分离单核细胞。10⁵单核细胞与LPS(100 ng/ml)共培养16 h，取上清获得sTNF-α；而 细胞则用1%多聚甲醛室温下固定15 min，用PBS洗3次后，继续在培养液中培养12 h，以 去除残留的sTNF-α，从而获得mTNF-α。

1.4TNF-α生物活性检测取10⁴靶细胞加入稀释培养上清，以检测sTNF-α；测定mTNF-α时，则按效：靶比例10∶1，向固定效应细 胞加入靶细胞，总反应体积为100 μ1/孔，37℃培养48 h后，每孔加入25 μ1的0.5%MTT， 继续培养4 h，弃上清，向孔内加入100 μ1裂解液(50%二甲基甲酰胺，20%SDS)，37℃摇荡1 6 h后，在波长570 nm下测吸光度。按以下公式计算TNF-α的胞毒效应(即细胞死亡百分率) ：

用抗TNF-α的单克隆抗体可完全拮抗二型TNF-α的胞毒效应，从而证实 其特异性。

1.5流式细胞仪定量检测细胞凋亡和坏死收集TNF处理细胞，离心 后，用PBS洗3遍，加入Hoechst 333258 (1 μg/ml)，37℃水浴7 min，迅速置冰上10 min 。用PBS洗1次后，再用5 μg/ml的PI染液悬浮细胞，置冰 上避光染色10 min，400 r/min离心5 min，用PBS洗2遍后，将细胞悬浮于500 μ1 P BS中，上机检测10 000个细胞。利用双标记及散射参数可将正常、坏死与凋亡细胞区分开。

2结果

2.1PKA激活剂对二型TNF-α胞毒效应的影响图1显示mTNF-α可 杀伤实验所用6株靶细胞，但sTNF-α则仅能杀伤其中2株。用PKA激活剂Forskolin(10 μmo l/L)可增强sTNF-α对MCF-7和L929的胞毒活性(P＜0.001)，却不能逆 转其余4株靶细胞对sTNF-α的耐受。将Forskolin的浓度增加10倍，仍无效 (结果未显示)。与sTNF-α不同，PKA激活剂对mTNF-α胞毒作用均无明显影响(P＞0.05)。

图1PAK激活剂对sTNF-α或mTNF-α细胞毒作用的影响

Fig.1The effect of PKA activator on

the cytotoxicity of sTNF-α or m TNF-α

2.2PKA激活剂对sTNF-α介导靶细胞死亡方式的影响图2显示sTNF-α对MCF-7的胞毒效应几乎完全表现为坏死，而PKA激活剂Forskolin不但使 sTNF-α胞毒效应增强，而且使该靶 细胞近42%的坏死转变为凋亡。对L929亦是如此，PKA激活剂使sTNF-α引起的坏死比例降低 (由35.4%下降为26.8%)，而凋亡比例增加(由20.8%上升至40.9%)。

图2PAK激活剂对sTNF-α引起靶细胞死亡方式的影响

Fig.2The effect of PKA activator on the

dead modes of target cell ind uced by sTNF-α

2.3PKA抑制剂对二型TNF-α胞毒效应的影响在培养液中加入PKA抑制剂H8(15 μmol/L)，可抑制sTNF-α对 L929和MCF-7的胞毒作用 近一半(P＜0.01)，但对其余4株靶细胞无作用。与PKA激活剂一样，PKA 抑制剂对mTNF-α的胞毒效应也无明显影响。

3讨论

我们的结果证实mTNF-α与sTNF-α在胞毒效应上存在明显差异，因为实验所用的6株靶 细胞均对mTNF-α敏感，却只有其中2株可被sTNF-α杀伤，而另外4株则不敏感(图1)。 即使对于这2株敏感靶细胞，二型TNF-α引起的死亡方式亦不同：mTNF-α主要引起凋亡 ［1］；而sTNF-α对MCF-7几乎完全引起坏死，对L929引起的坏死占胞毒效应的62.9% ，而凋亡则占37.1%(图2)。这些差异提示二型TNF-α杀伤靶细胞的信号传导途径可能不同 。

有人报道糖皮质激素或PGE2可引起小鼠胸腺细胞及其它类型淋巴 细胞的cAMP水平显著升高，并导致凋亡。故PKA被认为是参与凋亡的信号传导途径之一。本 实验证实PKA也参与sTNF-α杀伤效应的信号传导，因为：(1)用PKA激活剂Forskolin或抑制 剂H8，可分别增强或减弱sTNF-α对其敏感靶细胞的杀伤作用，H8的抑制 率可达50%左右(图1和3)；(2)PKA激活剂还可使sTNF-α介导的靶细胞死亡方式发生明显改 变，即由原来坏死为主转变成以凋亡为主(图2)。Chun M报道，sTNF-α可引起 L929胞内cAMP增高，而cAMP增高又可增强L929对sTNF-α的敏感性^［3］。Kizaki 等 给予外源性rTNF-α显著增强cAMP诱导的胸腺细胞凋亡^［4］。这与我们的实验结果相似， 提示sTNF-α与cAMP在诱导细胞凋亡时密切相关。

图3PAK抑制剂对sTNF-α或mTNF-α细胞毒作用的影响

Fig.3The effect of PKA inhibitor on

the cytotoxicity of sTNF-α or m TNF-α

本实验首次证实mTNF-α与sTNF-α不同，其胞毒作用与PKA信号传导途径 无明显关系， 因为PKA抑制剂和激活剂均不能明显影响mTNF-α的杀伤活性。提示mTNF-α诱导靶细胞 死亡信号可能遵循PKA之外的其它途径，如PKC、PLA2途径等。此外，PKA 激活剂虽然可增强sTNF-α对其敏感靶细胞的胞毒效应，却不能逆转sTNF-α对其耐受靶细 胞的敏感性。提示由于不明原因，sTNF-α不能有效激活其耐受靶细胞PKA通路；而mTNF- α则可绕过此通路，导致靶细胞凋亡。这可能是mTNF-α比sTNF-α具有更广杀瘤谱的原因 之一。

国家自然