摘要目的：为了探讨IL-12对狼疮肾炎PBMC发挥生物学作用的细 胞 内信号传递机制。方法：采用MTT、免疫沉淀、免疫印迹等方法，检测I L-12对PBMC增殖及STAT₃、STAT₄的作用 ，并比较在狼疮肾炎活动期、静止期的差别。结果：发现与正常人对照 及静止期相比，IL-12对活动期PBMC不需要IL-2的预诱导，可促进PBMC增殖并在短时间内 激活 STAT₃、STAT₄，而IL-2对STAT₄无作用。结论：表明IL-12对PB M C的作用可通过STAT₃、STAT₄途径发挥，活动期PBMC存在异常活化，这可能是IL-12促 进狼疮肾炎PBMC参与发病的细胞内机制之一。

中国图书分类号R392.12

Effects of IL-12 on signal transduction molecules STAT₃ and STAT₄ in PBMC i n lupus nephritis

LI Qing-GangLI You-JiLI Zhi-Jian

（Department of Nephrology and Ins titute of Nephrology, The First Affiliated Hospital, San Yat-Sen University of Medica l Sciences, Guangzhou 510080）

AbstractObjective：To investigate the mechanism of signa l transduction of IL-12 on periph eral blood mononuclear cell (PBMC) in lupus nephritis (LN).Methods：The authors measured proliferation of PBMC by MTT. STAT₃ and STAT₄ were detected by immunoprecipa tion and Western Blot Technique. Results:In contrast to norma l group and the static stage of LN, IL-12 alone stimulated DNA synthesis and activated STAT₃ and ST AT₄ in absence of IL-2 in short time in PBMC in the active stage of LN, wherease I L-2 had no effect on STAT₄ but STAT₃.Conclusion：The e ffe ct of IL-12 in PBMC may be mediated through the activation of STAT₃ and STAT₄, PBMC may have been abbe rant ly activated in the active stage of LN, which may be a mechanism of IL-12 to ta ke part in the pathogenesis of LN.

Key wordsSignal transductionLupus nephritisInterl eukin-12PBMC

狼疮肾炎外周血单个核淋巴细胞(PBMC)的异常增生、分化，产生多种活性物质、分泌过多自 身抗体是其致病的重要环节。最近国外报道，IL-12可对正常人B、T淋巴细胞在IL-2、SA 等诱导作用下发挥重要作用^［1，2］。然而，对狼疮肾炎PBMC异常生物学行为的细胞 内信号传递 机制至今未见报道。信号的转录子和活化子(signal transducers and activators of tran scription, STAT)中STAT₃、STAT₄是IL-12的信号传递途径^［3］，故在 本研究中，我们对IL-2 诱导或未诱导的正常人、LN活动期、静止期是否发生异常活化进行测定，试图对IL-12在狼 疮肾炎PBMC中作用的细胞内信号传递机制进行探讨，以期深化对LN发病过程中IL-12作用机 制的认识。

1材料与方法

1.1试剂IL-12购自Pepro Tech公司，IL-2、PHA购自北京中山生物 技术公司。STAT₃、STAT₄及其他蛋白测定试剂均购自Santa Cruz公司。MTT、蛋白酶抑制剂均购自Sigma公司，电泳分子量标准 品购自New England公司，化学发光试剂购自北京医科大学引航医学生物技术研究所。

1.2方法

1.2.1PBMC分离培养选取LN活动期、静止期患者各10例、正常人对照5 例 ，按常规方法抽取10 ml静脉血，肝素抗凝分离PBMC作培养，0.2%台盼蓝计数存活＞95%。

1.2.2 细胞因子对PBMC的刺激在STAT₃、STAT₄测定实验中，对LN 活动期、静止期、正常对照组PBMC分别给予0，100 U/ml IL-2预诱导24 h。然后分组 给 予10ng/ml IL-12于37℃刺激30 min。另一组给未用IL-2预诱导的LN活动期PBMC以2，5 ，10 ng /ml IL-2刺激5，15，30，60，120 min。

1.2.3 STAT₃、STAT₄的测定将培养的细胞，用含蛋白酶抑制剂的 RIPA细胞裂解液(1×PBS，10%NP40，0.5%脱氧胆酸钠，1 μg/ml PMSF，30 μl/ml抑 肽酶，0.1 mmol/L钒酸钠)裂解2 h，离心，将上清液测定蛋白含量。然后用抗STAT₃、抗S TAT₄(抗C-末端)免疫沉淀，过夜，最后离心提取蛋白沉淀经100℃ 2 min变性，贮存于-2 0℃冰箱备用。经SDS-PAGE电泳、转膜，用化学发光方法检测磷酸化信号 传递蛋白，可在92,94 kD处各出现一条带。然后将膜置于洗膜中60℃，洗膜30 min，再 利用抗STAT₃、STAT₄(N-末端)对膜进行孵育。每组实验重复3次。

1.2.4 PBMC增殖测定采用MTT法检测PBMC增殖，按上述分LN活动期、 静止期及正常对照分组分别加入IL-2(100 U/ml)，IL-12(10 ng/ml)，IL-2(100 U/ml)+I L-12(10 ng/ml)刺激4 d，同时设阴性空白对照，加入MTT培养4 h后，用20%SDS，50%二甲 基酰胺 ，pH5.0溶解液终止反应，在2400酶标仪测570～630 nm吸光光度值，以空白对照为标准， 评价各组的PBMC增殖。

1.2.5统计学方法结果以±s表示，各组比 较用t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1PBMC增殖正常人对照，狼疮肾炎PBMC对IL-2都有反应，而IL- 12 只对LN活动期增殖反应显著，IL-2+IL-12对三者皆有明显促增殖作用，尤以活动期显著( 图1)。

图1IL-12、IL-2、IL-12+IL-2对LN、正常对照PBMC增殖

Fig.1IL-12,IL-2 and IL-12+IL-2 stimulated PBMC

proliferation in LN and normal group

2.2PBMC的STAT₃，STAT₄酪氨酸磷酸化于0～120 min单独用IL - 12(5～10 ng/ml)刺激活动期PBMC的结果见图2。单独用IL-12可使LN活动期STAT₃、STAT₄ 在30 min时合成最强，并且以10 ng/ml浓度刺激的带型最强，120 min后带型消失，从图3 看出单独IL-12对静止期相对作用较弱，正常人无作用。联合应用IL-2+IL-12，正常对 照、LN活动期、静止期在30 min仍最强。

图2不同浓度的IL-12刺激LN活动期PBMC中STAT₄ 、STAT₃的酪氨酸磷酸化

Fig.2Different concentration of IL-12 induces tyrosine

phosphorylatio n of STAT₄ and STAT₃ in PBMC in the active stage of LN

图3IL-2、IL-12、IL-2+IL-12对LN、正常对照PBMC刺激30min

诱导STAT₄和STAT₃酪氨酸磷酸化

Fig.3IL-2, IL-12 and IL-2+IL-12 induce tyrosine phosphorylation

of S TAT₄ and STAT₃ in PBMC in LN and normal control for 30 min

3讨论

IL-12主要是由T、B淋巴细胞和单核-巨噬细胞产生的，具有多种炎症作用，包括促进IFN -γ的产生，抑制IL-10、IL-11等的合成^［4，5］，其对Th前体细胞向Th1分化不 可缺少 ，通过调节Th₁/Th₂平衡，发挥免疫调节作用^［6］，此外，有报道IL-12 对SA、IL-2诱导的正常T、B淋巴细胞有促增殖、分化作用^［1，2］。然而，尽管IL -12在体外对正常T、B等淋巴细胞的免疫炎症过程的重要作用已有些研究，但在狼疮患者IL -12作用的内在机制尚未有报道。

我们在实验中发现，单独IL-12对正常人PBMC无增殖作用，而与IL-2可共同刺激增殖，这 提示其生物学作用需IL-2诱导才能发挥。Gately等认为：在低浓度IL-2诱 导下，介导促进IL-2受体表达，导致IL-12诱导PBMC等亚群的增殖，另外，IL-12还可通 过诱导细胞因子如INF-γ、IL-2等的释放，促进静止PBMC对IL-2反应^［6］。而L N患者PBMC，尤其是活动期，可能由 于PBMC已经在体内被多种炎症因子预刺激促进了IL-12R受体表达，或其本身存在异常，故 可直接对IL-12发生增殖反应。

许多的研究证实，在正常细胞，IL-12发挥生物学作用可通过STAT₃，STAT₄途径实现 ，并且STAT₄只有IL-12才能激活^［3］。IL-12与受体结