摘要目的：提高肿瘤细胞的免疫原性。方法：将异基因型或同基因型的MHCⅡ类基因转染至小鼠肥大细胞瘤P815中，用此细胞接种同系小鼠，1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型P815细胞，观察小鼠的存活情况。结果：转同基因型MHCⅡ基因的P815细胞接种同系小鼠后，4/10不成瘤，而异基因型MHCⅡ基因转染组，10/10不成瘤。1个月后给不成瘤的小鼠再接种野生型的P815细胞，同基因型转染组2/4不成瘤，异基因型转染组7/10不成瘤。结论：研究说明MHCⅡ基因转染具有使肿瘤细胞的致瘤性下降、免疫保护能力提高的作用；并且异基因型比同基因型MHCⅡ类基因转染的效果更佳。

中国图书分类号R733

Allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ gene transfection and their effects on immunogenicity of murine mastocytoma

SUI Yong-JunTANG Pei-XianHOU Chun-Mei et al.

（Institute of Basic Medical Sciences ,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850）

Abstract：Objective:To enhance the immunogenicity of tumor cells.Methods:Allogeneic or syngeneic MHC class Ⅱ gene was transfected into murine mastocytoma P815.Then the transfected cells were inoculated into the syngeneic mice and one month later ,mice free of tumors were challenged with wild type P815 cells.The survival rate of the mice was observed.Results:4/10 mice were free of tumors when inoculated with syngeneic MHC class Ⅱ gene modified P815 cells,while 10/10 mice were free of tumors when inoculated with allogeneic one.One month later,the mice free of tumors were challenged with wild type P815 cell and the survival rate of syngeneic group was 2/4,while the allogeneic one was 7/10.Conclusion:Expression of MHC class Ⅱ molecular remarkably reduced the tumorigenicity of the modified cells and vaccination with MHC class Ⅱ-expressing P815 cells protected the mice from subsequent challenge with wild type P815 cells.Furthermore,allogeneic MHC class Ⅱ transfection was better than syngeneic one in their ability to generate immune-protection effects.

Key words：MHC class II gene transfection Allogeneic Syngeneic TumorigenicityImmunogenicity

小鼠的肥大细胞瘤细胞系P815表达肿瘤特异性抗原P815A等^［1］，但是一般情况下，免疫力健全的同系小鼠却无法产生针对P815细胞的免疫应答。其中的一个原因可能是P815细胞只表达MHCⅠ类抗原，而不表达Ⅱ类抗原。在肿瘤免疫中，至少需要2种T细胞：CD8^＋T细胞识别肿瘤细胞上与MHCⅠ分子结合的特异性抗原，直接杀伤肿瘤细胞^［2］；CD4^＋T细胞识别抗原提呈细胞上的与MHCⅡ类分子结合的特异性抗原，激活后为CD8^＋T细胞的激活提供辅助信号^［3］。如果肿瘤细胞能够表达MHCⅡ类抗原，即可直接激活CD4⁺T细胞，而不需要经过宿主APC，可能会诱导更加有效的抗肿瘤免疫反应。在本研究中，我们用小鼠的肥大细胞瘤系P815，分别将小鼠的IA^k和IA^d基因转移到其中，构建了异基因型(Allogeneic)和同基因型(Syngeneic)MHCⅡ类基因转染的模型，比较了它们的致瘤性和免疫原性的改变。

1材料与方法

1.1细胞系小鼠肥大细胞瘤细胞系P815培养于DMEM培养液中，添加10%的小牛血清。

1.2细胞转染采用Lipofectamine转染法或者磷酸钙共沉淀法。连接在pcEXV-3载体中的IA^kα和IA^k β cDNA(由 Ostrand-Rosenberg S提供^［4］)各10 μg以及pLXSN空载体1 μg混匀后共同转染P815细胞；连接在pcEXV-3载体中的IA^d α和IA^d β cDNA(由 Steiman R提供)各10 μg以及PLXSN空载体1 μg混匀后共同转染P815细胞，具体操作过程参照说明书。以上2种转染体都用600～800μg/ml的G418进行筛选，直到出现抗性克隆。用转PLXSN空载体的P815细胞作对照。

1.3流式细胞术检测细胞表面MHCⅡ类分子的表达MK-D⁶mAb(ATCC)针对小鼠的IA^d；OX-6(Sigma)mAb针对小鼠的IA^k。流式细胞术分析过程如下：细胞经PBS洗涤后，调节细胞浓度为1×10⁷ml^-1，取100μl细胞悬液加10μl抗IA^d或IA^k抗体，室温孵育30min，用含1%BSA的PBS(pH7.4)洗涤2次后，加FITC标记的羊抗小鼠二抗10 μl,室温孵育30 min，1%BSA的PBS(pH7.4)洗涤2次后，2%多聚甲醛固定，用于FCM检测(仪器为美国B-D公司FACStar)。

1.4动物实验同DBA/2雄性小鼠(北京医学科学院药品鉴定所)40只，随机分成4组，每组10只，分别皮下注射1×10⁵以下各组细胞：P815、P815-空载体、P815-IA^k和P815-IA^d。3次/w观察肿瘤的生长情况。4 w 后，未成瘤的小鼠进行以下的实验：每只小鼠皮下注射1×10⁵的野生型的P815细胞，3次/w观察肿瘤的生长情况，15 w后结束实验。

2结果

2.1同基因型和异基因型MHCⅡ类基因转染模型的构建P815细胞是在DBA/2纯系小鼠(H-2IA^d)中诱导的肥大细胞瘤，经过FACS检测发现，其MHCⅡ类抗原的表达为阴性(见图1)。将IA^dcDNA转到P815细胞后所获得的P815 -IA^d细胞，因为MHCⅡ类抗原的表达与同系小鼠的MHCⅡ类抗原相一致，所以是同基因型MHCⅡ类抗原转染的模型；同样，将IA^kcDNA转到P815细胞后所获得的P815-IA^k细胞成为异基因型MHCⅡ类抗原转染的模型。我们应用lipofectamine转染法或者磷酸钙共转染的方法，在600～800 μg/mlG418浓度下经过大约14～21 d左右的筛选，分别获得了对G418具有抗性的以上2种细胞。为了检测这2种细胞中MHCⅡ类抗原的表达，我们用流式细胞术进行了分析，结果(见图1)表明：此2种细胞中都有相应的MHCⅡ类抗原的表达。

图1流式细胞术分析野生型及转基因P815细胞中MHC Ⅱ基因的表达

Fig.1Flow cytometric analyses of syngeneic or allogeneic MHC class Ⅱ gene expression on wild type and transfected P815 cells

Note:a.P815-IA^d cells were staining of fluorescent conjugate without IA^d mAb;b.P815 cells were staining of IA^dmAb plus fluorescent conjugate;c.P815-IA^d cells were staining of IA^dmAb plus fluorescent conjugate;d.P815-IA^k cells were staining of fluorescent conjugate without IA^kmAb;e.P815 cells were staining of IA^kmAb plus fluorescent conjugate;f.P815-IA^kcells were staining of IA^k plus fluorescent conjugate

2.2转染MHCⅡ类基因的P815细胞的致瘤性下降转染了同基因型和异基因型MHCⅡ类基因的P815-IA^d和P815-IA^k细胞接种在P815细胞的同系小鼠DBA/2皮下后都不同程度出现了肿瘤生长缓慢或者不成瘤、小鼠的生存期延长或者长期存活的现象，表明其致瘤性出现了下降。从图2中我们可以看到，转染MHCⅡ类抗原的P815细胞的致瘤性是：P815-IA^k＜P815-IA^d，其中P815-IA^k组10只小鼠在接种1个月后全部未成瘤，而对照组全部成瘤且瘤体平均直径超过16 mm。P815-IA^d组仅部分小鼠(4只)不成瘤，但成瘤小鼠的瘤体直径小于对照组(P＜0.01)。

图2MHCⅡ类基因转染到P815细胞体内生长的影响

Fig 2Effects of MHC Ⅱ genes transfection on P815 cells growth in vivo

Note:P815-IA^d has two lines,one(n=6) represents 6 mice with large tumor burdens;the other(n=4) represents 4 mice free of tumor

2.3转染MHC Ⅱ类基因的P815细胞的免疫原性提高第1次接种未成瘤的小鼠，在接种后1个月第2次接种野生型的P815细胞，结果如表1所示。我们发现2组小鼠的免疫原性都有所提高，可以保护后续的野生型P815细胞的攻击。它们对免疫原性提高的能力是：P815-IA^k＞P815-IA^d，显示了异基因型MHC Ⅱ类基因转染比同基因型MHCⅡ类基因转染具有更良好的作用效果。

表1表达异基因型或同基因型MHC Ⅱ类分子的DBA/2小鼠P815细胞免疫保护野生型P815细胞的攻击