摘要：目的：为了探讨肿瘤细胞的靶向性杀伤途径。方法：采用PCR-Cloning技术和DNA重组技术，构建了2类IL-2-PE40’嵌合基因的表达载体，分别由IPTG和温度(42℃)诱导表达，并对表达产物进行了酶切片段大小、电泳迁移率、分子量、IL-2和PE40’组分抗原性及细胞学效应的检测。结果：发现重组毒素对表面表达IL-2受体的活化T淋巴细胞具有明显杀伤效应，并有抑制混合淋巴细胞反应的作用。结论：该IL-2-PE40’融合蛋白确实具有明显的特异性免疫抑制效应。

中国图书分类号：R392.11Q784

The cloning，expressing of IL-2-PE40’ chimeric gene and cytotoxic effect on the activated IL-2R⁺ lymphocytes

BI Mei-Xia

（Department of Ethology,Institute of Oncology,Peking Union Medical College & Chinese Academy Medical Science,Beijing 100021.）

YANG Yu-Zhen

（Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030）

SHU Ping

（Department of Medical Molecular Biology ,Research Center of Experimental Medicine,Tongji Medical University,Wuhan 430030）

Abstract：b：To find a therapeutic pathway special to kill tumour cells.Methods:The PCR-cloning technique was used to construct three prokaryotic expressing vectors into which chimeric IL-2-PE40’ gene fragment was inserted and induced to express by IPTG or 42℃ respectively.The SDS-PAGE、ELISA、cytological and enzymological assay were also used to identify the different characteristic of the expressed product.Results:It was found that IL-2-PE40’ fusion protein was very toxic to the activated IL-2R⁺ T-lymphocytes and able to inhibit mixed lymphocytes reaction in vitro.Conclusion:The IL-2-PE40’ fusion constructed had obvious inhibition to body immune function.

Keywords：Recombination toxinIL-2Pseudomonas exotoxinImmune inhibition

PE(Pseudomonas Exotoxin A)是绿脓杆菌分泌的毒素蛋白，其分子由3个结构域组成。利用DNA重组技术,用IL-2的cDNA片段取代PE基因的细胞识别功能区(domain la)后所构建成的嵌合基因^［1］，所表达的融合蛋白能特异性地作用于IL-2受体阳性细胞(IL-2R⁺)，由受体介导的内吞途径进入细胞内，使多肽延长因子EF-2因ADP核糖基化失活，导致细胞死亡。IL-2重组毒素有望作为一种新型的特异性免疫抑制剂，用于抗移植排斥反应、自身免疫性疾病的治疗^［2，3］。本课题研究了IL-2重组毒素的克隆、表达及表达产物的特异性细胞杀伤效应。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒、菌株及细胞系pUC19及pTLIL-2克隆载体为本室保存；表达载体pRSET(A)、(B)、(C) 为Invitrogen公司产品;表达载体pBV200和pBV201由中国预防医学科学院病毒所构建。HL60细胞、JM109、DH5α、BL21(DE3)均为本组自存；绿脓杆菌产外毒素标准株PA103由美籍华人张延龄教授惠赠。

1.1.2试剂基因工程实验所用的各种试剂均购于华美生物工程公司，IL-2单克隆抗体由卫生部武汉生物制品所提供，PA103抗血清由军事医学科学院微生物及流行病研究所购得。

1.1.3仪器PE480 DNA热循环仪、CO₂培养箱及基因工程实验所需仪器设备。

1.2方法

1.2.1原核表达载体Y1、Y2、Y3的构建我们分别设计了2对引物，序列如下：P1 5’-CCGctgcagAGTCATCGCCTGCACTTT-3',P2 5'-CCGgaattcTTACTTCAG-GTCCTCGC-3',5'端分别加入Pst I和EcoR I 的酶切位点，用于扩增和克隆PE基因的I b+II+III区的DNA片段；第2对引物的序列为：P3 5’-CTCgaattccatatgGCACCTACTTCAAGT-3',P4 5'-GGCActgcagTGTTGAGATCATGCTTTGAC-3', 5'端分别加入EcoR I+Nde I和Pst I的酶切位点，用于扩增和克隆IL-2的DNA片段，见图1。嵌合基因表达载体pBIP40'(简称Y1)的构建及鉴定见文献［4］。嵌合基因表达载体pBV220-IP40'、pBV221-IP40'(简称Y2、Y3)为先用EcoR I酶切Y1和载体pBV220或pBV221，去磷酸化处理后，进行连接及转化实验，用菌落PCR方法筛选阳性菌落，再经酶切鉴定，筛出含正向插入片段的质粒。

图1Y1、Y2、Y3载体构建图

Fig.1The construction of vector Y1，Y2，Y3

1.2.2重组毒素的诱导表达及表达产物的鉴定加入IPTG诱导Y1载体表达，Y2和Y3为温敏载体，升温至42℃诱导表达。于3、6 h和过夜3个时间点分别收集菌液，超声破菌，进行SDS-PAGE电泳分析，离心后收集上清和沉淀，进行ELISA检测^［5］。

1.2.3重组毒素IL-2-PE40'初纯品的制备超声破菌后,离心收集包涵体,按文献［6］进行变性、复性，在最后得到的上清中加入复性液,对 0.01 mmol/L的PBS透析48 h，期间共换液6次。于透析前、中、后分别取样,加到培养的HL60细胞中, 共同孵育6、12、24、48 h,同时设PBS、盐酸胍、RPMI1640等作为对照,观察纯化过程中所使用的化学试剂对细胞有无直接毒性作用,以确定进行细胞学实验时应该采用的最大无毒浓度。

1.2.4IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定取健康人抗凝外周血,按常规制备转化的淋巴母细胞，悬浮后加入适当浓度的IL-2以维持活化淋巴细胞的生长，继续培养3 d，换液后按2×10⁶ ml^-1的密度，以100 μl/孔的量重新铺于96孔培养板中，分别加入不同稀释度的IL-2-PE40'初纯品孵育，于6、24、48 h各取上清用MTT法测定IL-2-PE40'对淋巴细胞的毒性作用，为维持活化淋巴细胞的正常生长，曾经使用过0、1、5、10 U/孔不同浓度的rIL-2,以确定对IL-2-PE40'杀伤活性测定干扰最小的rIL-2的维持浓度。

1.2.5IL-2-PE40'初纯品对混合淋巴细胞杀伤效应的测定取2份健康人外周血，分离单个核细胞，按常规方法进行单向和双向混合淋巴细胞培养，分别加入IL-2-PE40'初制品原液(98 μg/ml)、1∶2稀释液(RPMI1640稀释)、同样处理的未转化菌(简称空白菌)的胞浆原液(87 μg/ml)及其1∶2稀释液各100 μl于混合细胞培养孔中，一式3份，同时设PBS与RPMI1640对照，培养24 h后用MTT法测定细胞的增殖率。

2结果

2.1IL-2-PE40'融合蛋白表达产物的鉴定诱导表达后转化菌的SDS-PAGE电泳显示在5.5 kD处有一新的融合蛋白条带(图2)，空载菌中则无此条带。由于我们设计的毒素片段比文献报道的大些，故以PE40’表示，薄层扫描显示该蛋白的表达量为18%～20%，用ELISA方法鉴定表达产物的免疫原性，证明确有IL-2和PE组份，并多以包涵体的方式存在，详见文献［5］。

图2IL-2-PE40’嵌合基因表达产物的SDS-PAGE图谱

Fig.2The SDS-PAGE of expressing products of IL-2-PE40’ chimeric gene

Note:Line 1(O/N)、2(6 h)、3(3 h):the expressing product of vector Y1 in E.coli;line 5(O/N)、6(6 h)、7(3 h):the expressing product of vector Y2/Y3 in E.coli;line 4:protein bands of standard molecular weight;line 8:cytosol protein of untransformed bacteria as a blank control.The arrow directs the band of fusion protein

2.2IL-2-PE40'初纯品最大无毒量的确定结果表明，透析48 h后的初纯品对细胞生长基本无影响，与细胞共孵育6、12、24、48 h后，细胞活度分别为90%、85%、80%、60%，与同时设立的RPMI1640对照组的细胞活度基本相同。未经透析或透析不彻底的初纯品中由于盐酸胍存在，孵育后48 h可致细胞全部死亡。由此可确定透析48 h后样品中盐酸胍已基本去除，其浓度即指定为它的最大无毒浓度。

2.3IL-2-PE40'初纯品对活化淋巴细胞杀伤效应的测定表1可见在不同IL-2浓度下(10、5、1、0U/孔，96孔)，以透析后的原液杀伤效应最大，48 h仍有一定的杀伤作用，而1∶2、1∶4稀释后，杀伤效应也依次降低。

表1IL-2-PE40'对活化淋巴细胞的杀伤效应(±s，OD₅₇₀，n=6)

Tab.1Killing effect of IL-2-PE40' on activated lymphocytes (<